結核病患者外周血γ干擾素釋放試驗假陰性的相關因素分析

俞珊 李志明 許春霞 王濤

外周血γ干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assay，IGRA)是一種檢測結核分枝桿菌感染的免疫診斷技術。檢測原理是人體感染結核分枝桿菌后，產生記憶性T淋巴細胞，當特異性結核抗原再次入侵時，記憶細胞就會迅速增殖活化形成大量的效應T淋巴細胞，釋放γ-干擾素(IFN-γ)。IGRA通過測定IFN-γ或能夠釋放IFN-γ的效應T細胞來判斷體內是否存在結核分枝桿菌感染[1]。錢宏波等[2]研究表明，IGRA對結核感染檢測的敏感度為81.7%～97.1%，特異度為75.2%～95.6%。臨床上有一部分患者雖然從痰液或膿液涂片中能夠找到抗酸桿菌，或者通過分子生物學、病理學能夠明確診斷為結核病，但是其外周血IGRA檢測為陰性。本研究收集2018年1月至2020年3月解放軍總醫院第八醫學中心結核四科收治的診斷明確、資料完整的38例外周血IGRA檢測陰性結核病患者的資料，與同期收治的119例IGRA檢測陽性結核病患者的資料進行對照，分析可能導致外周血IGRA檢測假陰性的影響因素。

資料和方法

一、資料收集

1. 研究對象： 2018年1月至2020 年 3月解放軍總醫院第八醫學中心收治的符合納入和排除標準，資料完整的157例結核病患者。

2. 納入標準：(1)年齡18～70歲；(2)結核病診斷明確：符合中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會發布的《WS 288—2017肺結核診斷》[3]和《WS 196—2017結核病分類》[4]：通過標本抗酸染色、分子生物學、培養或病理明確診斷為結核病患者。

3. 排除標準：(1)并發免疫系統相關疾病或腫瘤；(2)進行骨髓或器官移植；(3)長期大量使用糖皮質激素或免疫抑制劑；(4)標本培養或菌種鑒定為非結核分枝桿菌；(5)存在心、肺、腦、肝、腎嚴重損傷；(6)孕期或哺乳期婦女；(7)HIV感染者及 AIDS 患者；(8)未收集到完整資料。

4. 分組情況：按照IGRA檢測結果分為IGRA假陰性組和IGRA陽性組。最終納入結核病患者157例，其中IGRA假陰性組38例，IGRA陽性組119例。

二、納入患者一般資料

157例患者中，男102例，女55例；年齡中位數(四分位數)“M(Q1，Q3)”44.0(29.0，58.0)歲，病程M(Q1，Q3) 3.0(1.1，7.0)個月。IGRA假陰性組38例，其中，男24例，女14例，年齡M(Q1，Q3) 46.5(29.5，63.2)歲，病程M(Q1，Q3) 3.5(1.0，7.8)個月。IGRA陽性組119例，其中，男78例，女41例，年齡M(Q1，Q3) 42.0(29.0，56.0)歲，病程M(Q1，Q3) 3.0(1.1，7.0)個月。兩組患者性別、年齡、治療史、采血前抗結核治療時間、病灶部位、耐藥情況、糖尿病病史、吸煙史、飲酒史、結核抗體檢測等方面差異均無統計學意義，具有可比性(表1)。

續表1

三、檢測方法

收集確診患者本次住院治療前外周血IGRA、CA125、血紅細胞沉降率(ESR)、C反應蛋白(CRP)和T細胞亞群結果。

1. IGRA檢測：采用北京萬泰生物藥業股份有限公司生產的血IGRA測定試劑盒(體外釋放酶聯免疫吸附法)檢測外周血IGRA。結果判定標準：按照試劑盒說明書進行，每個測試分為“N-陰性孔”“T-檢測孔”“P-陽性孔”3個孔。N孔檢測體內基礎 IFN-γ含量，T孔檢測經結核分枝桿菌特異性抗原刺激全血后，被結核分枝桿菌感染的特異性T細胞釋放的IFN-γ含量，P孔檢測植物血凝素(PHA)非特異性刺激全血中T細胞釋放的IFN-γ含量，當T 管與N 管含量差值(T-N)≥14且≥N/4 時，結果判定為陽性；當T-N<14時，結果判定為陰性。

2. CA125檢測：采用美國貝克曼庫爾特UniCel DxI 800全自動化學發光免疫分析儀檢測CA125在血清中的濃度(正常參考值：0～35 U/L)。

3. ESR檢測：采用魏氏法檢測ESR(正常參考值：0～20 mm/1 h)。

4. CRP檢測：采用美國貝克曼庫爾特AU5800全自動生化分析儀檢測CRP在血漿中的濃度(正常參考值：0～4 mg/L)。

5. T細胞亞群檢測：采用美國貝克頓-迪金森公司分選式流式細胞儀檢測外周血 T細胞、CD4+T 細胞、CD8+T 細胞、CD4+T/CD8+T、自然殺傷T細胞(natural killer T，NKT細胞)、自然殺傷細胞(NK細胞)及B細胞計數和百分比(正常參考值：T細胞計數966～2860個/μl，T細胞百分比0.50～0.84，CD4+T細胞計數550～1440個/μl，CD4+T細胞百分比0.27～0.51，CD8+T細胞計數320～1250個/μl，CD8+T細胞百分比0.15～0.44，CD4+T/CD8+T 0.71～2.78，NK細胞計數150～1100個/μl，NK細胞百分比0.07～0.14，NKT細胞計數40～300個/μl，NKT細胞百分比0.02～0.13，B細胞計數90～560個/μl，B細胞百分比0.05～0.18)。

6. 淋巴細胞檢測：采用法國ABX公司ABX PENTRA DF 120全自動五分類血細胞分析儀檢測淋巴細胞計數及百分比[正常參考值：淋巴細胞計數(0.8～4)×109/L，淋巴細胞百分比20%～40%]。

四、統計學處理

采用SPSS 26.0軟件進行統計學分析。本研究計量資料呈偏態分布，以M(Q1，Q3)表示，采用 Mann-WhitneyU檢驗進行組間比較；計數資料采用“例數”和“構成比(%)”表示，采用χ2檢驗進行組間比較。以IGRA檢測結果(陽性和假陰性)為因變量，采用多因素logistic回歸分析與IGRA檢測出現假陰性有關的因素，采用逐步法進行變量篩選。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、兩組患者血清生化指標的比較

兩組患者CA125、ESR、CRP、淋巴細胞百分比差異均無統計學意義；IGRA假陰性組淋巴細胞計數明顯少于IGRA陽性組，差異有統計學意義。見表2。

表2 各血清生化指標水平在兩組患者中的比較[M(Q1，Q3)]

二、兩組患者T細胞亞群檢測結果

IGRA假陰性組患者T細胞計數、CD4+T細胞計數、CD8+T細胞計數和NKT細胞計數均明顯低于IGRA陽性組，差異均有統計學意義。見表3。

表3 各T細胞亞群水平在兩組患者中的比較[M(Q1，Q3)]

三、多因素分析

將IGRA假陰性組和IGRA陽性組差異有統計學意義的指標，包括淋巴細胞計數、T細胞計數、CD4+T細胞計數、CD8+T細胞計數、NKT細胞計數納入進行logistic回歸分析，以正常值為參照進行變量賦值(表4)。結果顯示，NKT細胞計數低于正常值(<40個/μl)的患者，IGRA檢測出現假陰性的風險是NKT細胞計數正常者的2.440倍。見表5。

表4 變量賦值表

表5 結核病患者IGRA檢測假陰性影響因素的logistic多因素回歸分析

討 論

IGRA是通過結核分枝桿菌特異性抗原刺激外周血淋巴細胞，然后檢測結核分枝桿菌抗原特異性T細胞產生的IFN-γ，用以判定是否存在結核分枝桿菌感染[1, 5]。目前主要有兩種IGRA檢測方法：(1)應用ELISA方法檢測全血樣本被結核分枝桿菌特異性抗原刺激后T細胞產生IFN-γ的水平。(2)運用酶聯免疫斑點技術(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)檢測被結核分枝桿菌特異性抗原刺激后能夠釋放IFN-γ的T細胞計數。當外周血淋巴細胞計數少于0.5×109/L時，ELISPOT 敏感度明顯高于ELISA[2]，本研究外周血淋巴細胞均大于0.5×109/L，故采用第一種檢測方法。IGRA對于結核感染檢測的敏感度為81.7%～97.1%，特異度為75.2%～95.6%[2]，明顯高于結核菌素皮膚試驗、結核抗體檢測，以及病原學、分子生物學和病理檢測效率，且不受既往卡介苗及糖皮質激素治療的影響，但仍存在一定比例的假陰性。

研究者對IGRA假陰性的影響因素結論不完全一致。Yamasue等[6]提出，高齡和低外周血淋巴細胞計數可能是IGRA假陰性結果的常見危險因素。Nguyen等[7]提出，高齡、HIV感染、非西班牙裔白種人與IGRA陰性結果相關，且IGRA結果為陰性的結核病患者死亡率較高，推測原因是治療延遲。錢宏波等[2]通過對387例艾滋病患者的檢測結果進行分析，發現艾滋病患者外周血CD4+T淋巴細胞計數≤50個/μl 時IGRA陽性率明顯下降。同樣全文和陸興[8]提出，在艾滋病并發結核病患者中，CD4+T淋巴細胞計數對TB-IGRA的陽性率有明顯影響，對于CD4+T淋巴細胞計數較低的患者，尤其是≤50個/μl的患者，IGRA的敏感度明顯降低。Pai等[9]提出，CD4+T細胞和CD8+T細胞明顯低于正常范圍的患者容易出現IGRA的假陰性結果。但是童鳳軍等[10]提出IFN-γ在HIV與MTB雙重感染者中有較高表達，IFN-γ水平在抗結核治療過程中呈現下降趨勢，但是其與CD4+T 淋巴細胞計數未見相關性。Kim 等[11]提出，肺外結核的IGRA假陰性率可達28.8%，尤其是胸膜及骨結核。Di和Li[12]亦提出肺外結核(如胸膜、骨結核及中樞神經系統結核)的假陰性比例明顯高于肺結核。Santos等[13]提出，年齡超過70歲和酗酒是肺結核IGRA陰性的影響因素，而肺外結核IGRA不受影響。丁興龍等[14]提出IGRA對矽肺并發肺結核及肺外結核的診斷敏感度一致。鐘華清等[15]通過對2200例非結核病患兒及34例活動性結核病患兒進行回顧性研究，發現IGRA檢測結果與性別、年齡、卡介苗接種史、結核病接觸史、機體免疫狀態和感染部位無關。巫麗蘭和譚守勇[16]提出IGRA檢測結果不受低蛋白血癥影響。徐瑤等[17]認為，初治抗結核治療2個月后IGRA的陽性率可能逐漸下降，但仍無法鑒別結核分枝桿菌潛伏感染及活動分期。綜上所述，IGRA的檢測結果受到多種因素的影響，如何分析和應用這個檢測結果是臨床診斷治療過程的一個熱點問題。

本研究已經排除已知的年齡過大、免疫抑制和腫瘤等影響因素，發現IGRA假陰性組和陽性組在性別、年齡、結核病灶部位、初復治、耐藥情況、采血前抗結核治療時間、糖尿病病史、吸煙史方面差異均無統計學意義，并且兩組患者ESR、CRP、CA125、淋巴細胞百分比等化驗指標差異亦均無統計學意義。

人體對結核分枝桿菌的免疫防御反應分為先天性免疫和適應性免疫。NK細胞是先天性免疫的主要參與者，T淋巴細胞是適應性免疫的代表[18]。T細胞主要由CD4+和CD8+T細胞組成。《結核病患者外周血淋巴細胞亞群檢測及臨床應用專家共識》[19]表明，結核病患者大部分會出現CD4+T細胞計數降低，因此其百分比相應降低，CD8+T細胞計數亦出現不同程度的降低，但其程度輕于CD4+T細胞，因此其細胞比例可能相對升高，導致CD4+/CD8+不變或降低。T淋巴細胞占淋巴細胞比例較高，其比例變化會引起其他細胞比例出現變化。重癥結核病患者T淋巴細胞總體降低，但比例可能無明顯變化。CD4+T細胞是產生IFN-γ的主要細胞，而CD8+T細胞亦能產生一定的IFN-γ。因此T細胞、CD4+和CD8+T細胞計數減少，IGRA的假陰性率可能會提高。

NKT是數量較少的一類細胞，發育成熟的細胞能同時表達T細胞的TCRαβ和NK細胞的NKR-P1受體[20]，具有T細胞和NK細胞兩重性質。活化的NKT細胞快速大量產生細胞因子，包括IFN-γ、IL-4 等，能夠調節細胞免疫。同時，NKT可釋放穿孔素、Fas 配體等溶解靶細胞，從而起到抗結核分枝桿菌的作用[21]。NKT細胞是聯系固有免疫和獲得性免疫的橋梁之一，對IFN-γ的釋放亦有較明顯的作用，可能影響IGRA的結果。

本研究發現，IGRA假陰性組外周血淋巴細胞、T細胞計數、CD4+T細胞計數、CD8+T細胞計數、NKT細胞計數均明顯低于陽性組，還發現這些結果低于正常值低限。logistic多因素分析結果顯示，NKT細胞減少是IGRA假陰性的危險因素。NKT細胞數越高，IGRA陽性可能性越大，NKT細胞數越低，IGRA假陰性可能性越大。這提示在臨床實踐中T細胞亞群檢測，尤其是NKT細胞計數有助于解釋IGRA結果。

本研究為回顧性分析，病例信息完整的患者數量有限，因此納入分析的患者例數較少，研究僅能反映出一種趨勢，供臨床工作者參考。此外，本研究回歸模型契合度較差，其診斷臨界值有待擴大樣本量進一步分析。