miR-381 在胰腺癌患者組織及外周血的表達及臨床價值

張文娟，邊 偉，王炳超，董 魁，楊雅娟，喬冠恩

（1.邯鄲市第一醫院消化科，河北 邯鄲 056002；2.河北醫科大學第二醫院普外一科，河北 石家莊 050000；3.邯鄲市第一醫院普外二科，河北 邯鄲 056002）

胰腺癌（pancreatic cancer）在世界范圍分布廣泛，是歐洲癌癥死亡的主要原因之一[1]，為我國常見的惡性腫瘤及主要的腫瘤死亡原因[2]。目前針對胰腺癌治療手段包括手術、化療、放療、靶向及免疫治療等，但總體治療效果較差，患者5 年生存率小于7%[3]。因此，積極尋找新的腫瘤標記物有助于早期診斷及治療，但到目前為止，胰腺癌確切的病因及分子調節機制尚未完全闡明。微小RNA (miRNAs)是非編碼小RNA，參與了人類大多數癌癥的分子調節過程[4，5]。目前所知，很多miRNAs 與胰腺癌的發生、發展有明顯聯系[6，7]，但有關miR-381 在胰腺癌中的具體功能研究，目前報道尚少。本研究采用反轉錄實時定量PCR（RT-qPCR）方法檢測胰腺癌患者組織、血清和健康者血清中的miR-381 水平，并結合臨床病理資料，探討其臨床價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017 年7 月～2018 年8 月邯鄲市第一醫院及河北醫科大學第二醫院確診的50 例胰腺癌患者的癌組織及外周血清，其中男27 例，女23 例，年齡45～78 歲，平均年齡59.4 歲。所有診斷均經過手術及病理證實，胰腺癌的TNM 分期采用第7 版美國聯合腫瘤委員會的病理分期標準[8]，抽取外周血前未行放療、化療、生物治療等干預措施，無其它腫瘤病史。另外選取患者的癌旁正常組織及同期50 例健康體檢者（男26 例，女24 例，年齡44～76歲，平均58.2 歲）血清樣本作為對照組，健康體檢者與胰腺癌患者性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑及儀器 Trizol 試劑購于北京天根生物公司，逆轉錄試劑盒購于美國Invitrogen 公司，PCR試劑盒購于徳國Roche 公司，通過Primer PremierV6.1 軟件設計引物序列，引物由南京金斯瑞公司合成。紫外分光光度儀為美國Beckman Coulter 公司生產，熒光定量PCR 儀7500HT 為美國ABI 公司產品，電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 標本釆集與處理 血清標本采集：抽取胰腺癌患者和健康體檢者空腹靜脈血3 ml，靜置30 min 后4 ℃，3500 r/min，離心10 min，取上淸液放入新的EP 管中，置-80 ℃冰箱保存。組織標本采集：于術后取胰腺癌患者癌組織及癌旁正常組織各約1 g，放入含有RNA 保護液的EP 管中，置-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 總RNA 的提取 血清RNA 的提取：取血清200 μl，加入400 μl Trizol 裂解液中，混勻后加80 μl氯仿，充分震蕩后放置3 min，4 ℃，12,000 r/min 離心15 min，收集上層水溶液，加680 μl 異丙醇并充分混勻，在室溫環境下放置30 min，4 ℃、12,000 r/min 離心15 min，收集沉淀，向帶沉淀的EP 管中加入500 μl，75% 4 ℃預冷的乙醇洗滌，4 ℃、5000 r/min 離心5 min，去除上清液，保留沉淀，室溫放置3 min 晾干，最后加30 μl RNase-Free ddH2O，充分溶解RNA。總RNA 經NanoDrop ND-2000 分光光度計測定濃度及純度，并電泳檢測RNA 完整性，質量合格后用DEPC 水溶解保存在-80 ℃，用于后續實驗。組織RNA 的提取：將保存在-80 ℃冰箱中的組織樣本取出稱重，放入有液氮的研缽中進行研磨，按100 mg組織樣本加1 ml Trizol 的比例添加Trizol 試劑，勻漿處理放置5 min，入新的EP 管中12,000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液600 μl 移入新的EP 管中，后續加氯仿、異丙醇及檢測等步驟同血清RNA 的提取。

1.3.3 反轉錄反應取2 μl RNA 加入到新的EP 管中，用DEPC 水加至11 μl，65 ℃恒溫放置5 min，冰浴5 min瞬時離心。將收集到的液體加入5×Reaction buffer 4.0 μl、dNTPs 2.0 μl、Rnase Inhibitor 1.0 μl、RT 酶1.0 μl，離心后42 ℃孵育1 h，70 ℃反10 min 后取出立即冰浴冷卻，合成cDNA，于-20 ℃保存。

1.3.4 實時熒光定量PCR 反應 按照Roche 公司的Fast Start Universal SYBR Green Master（Rox）熒光定量PCR 試劑盒來擴增目的基因，所有反應設立3 個復孔，采用20 μl 的反應體系，依次添加2×SYBR Green Mix 10 μl、cDNA 2.0 μl、正向引物及反向引物各1.0 μl、雙蒸水6.0 μl。miR-381 正向引物序列為5'-TAATCTGACTATACAAGGGCAAGC-3'，反向引物序列為5'-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3'；U6 正向引物序列為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物序列為 5' -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。通過1 個循環（95 ℃，3 min）的預變性，40 個循環的變性（94 ℃，12 s）、退火及延伸（62 ℃，25 s），最后進行熔解曲線分析（62 ℃～95 ℃，0.5 ℃/cycles，5 s/次）。根據各個孔熒光信號達到閾值的循環數作為Ct 值，以U6 為內參，用2-△△Ct體現樣本的相對表達量，ΔCt=基本循環數-內參循環數，ΔΔCt=待測樣本ΔCt-對照樣本ΔCt。

1.4 統計學方法 采用SPSS 23.0 統計軟件分析數據，計量資料采用（）表示，比較采用t檢驗，miR-381 表達量與患者臨床病理特征相關性采用Pearson 相關分析，ROC 曲線分析miR-381 對胰腺癌的診斷價值，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌組織、血清和健康者血清miR-381 表達情況 胰腺癌組織及血清miR-381 表達量分別為（0.72±0.26）、（0.79±0.34），均低于對照組癌旁正常組織及健康者血清中miR-381 的表達量（1.56±0.23）、（1.74±0.45），差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 胰腺癌患者miR-381 的表達與臨床病理特征的關系 不同腫瘤分期、淋巴結轉移的胰腺癌患者miR-381 的表達比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；不同性別、年齡的胰腺癌患者miR-381 的表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 胰腺癌患者miR-381 的表達與臨床病理特征的關系（）

表1 胰腺癌患者miR-381 的表達與臨床病理特征的關系（）

表1 （續）

2.3 組織、血清中miR-381 診斷胰腺癌的價值 組織miR-381 診斷胰腺癌的敏感性、特異性為84.51%及80.34%，胰腺癌血清miR-381 診斷胰腺癌的敏感性、特異性為82.31%及81.26%，見表2、圖1。

表2 組織、血清miR-381 診斷胰腺癌的價值

圖1 組織、血清中miR-381 診斷胰腺癌的價值

3 討論

miRNAs 是由20 個左右核苷酸構成的短鏈非編碼RNA，一般在轉錄后調節有關基因表達，可在腫瘤中發揮抑癌或促癌基因的功能[9]。在人類中約50%的miRNAs 所在的基因組區域與癌癥存在密切的聯系，癌組織中異常表達的miRNAs 對腫瘤的早期診斷、組織分型、轉移及預后等有著極其重要的價值[10]。作為潛在的腫瘤分子標志物，miRNAs 可在血液、尿液等中釋放和維持穩定[11，12]，因此，對腫瘤體液循環中miRNAs 的研究是當前的熱點[13，14]。

miR-381 位于人類染色體14q32.31 位點，屬于miR-154 基因家族[15]，在多種腫瘤中表達下調，具有調控腫瘤細胞遷移、侵襲、增殖等重要的功能。Zhang M 等[16]研究顯示，胃癌組織中miR-381 的表達明顯下調，miR-381 的低表達與淋巴結轉移和晚期腫瘤轉移有關，miR-381 的上調通過SOX4 介導的上皮-間質轉化抑制胃癌細胞的遷移和侵襲。Yang X 等[17]的研究顯示，miR-381 在口腔鱗癌組織和細胞系中均顯著低表達，miR-381 的過度表達可抑制口腔鱗癌細胞的增殖和細胞周期進程，促進細胞凋亡。Xue Y 等[18]驗證了miR-381 在乳腺癌組織及細胞系中均呈低表達，同時有研究發現miR-381的表達水平與乳腺癌細胞增殖、上皮-間質轉化和轉移呈負相關[19]。關于miR-381 在胰腺癌的表達情況，目前有少量報道。蔣林濤等[20]檢測了人正常胰腺導管上皮細胞系及胰腺癌細胞系中miR-381 的表達量，發現miR-381 在胰腺癌細胞系中呈低表達，miR-381 過表達可抑制胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。Qiao G 等[21]研究了miR-381 在胰腺癌中的表達及其功能作用，發現miR-381 在胰腺癌組織和細胞系中顯著下調；體外實驗證實，miR-381 的過表達可顯著抑制胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導其凋亡，沉默miR-381 的表達具有相反的效果。動物體內試驗顯示，miR-381 可抑制異種移植腫瘤生長，miR-381 在胰腺癌中具有抑癌作用。但對miR-381在血液中表達的情況目前尚未見報道。本研究發現，與癌旁正常組織、健康者血清相比，胰腺癌組織、血清的miR-381 表達均降低，提示miR-381 的低表達可能與胰腺癌的發病有關。

外周血miRNAs 作為腫瘤標志物的研究已取得了一定的成效[22，23]。本研究中，miR-381 在胰腺癌組織及血清中均呈低表達，且miR-381 的表達與腫瘤分期及淋巴結轉移密切相關，提示miR-381 的低表達可能促進胰腺癌的侵襲和轉移，因此miR-381 在胰腺癌的發展過程中可能起抑癌基因的作用。此外，本研究還發現，不論在組織還是外周血中，miR-381的表達均與患者年齡、性別無關，提示miR-381 的表達不受個體因素影響，其有可能成為臨床診治胰腺癌的潛在標志物。對組織、血清miR-381 診斷胰腺癌的ROC 曲線分析顯示，組織和血清中miR-381對胰腺癌的診斷敏感性、特異性均在80%以上，提示組織、血清中的miR-381 對胰腺癌的診斷有較高價值，特別是血清樣本中的miR-381，由于取樣便捷，更有可能成為潛在的腫瘤標志物。

綜上所述，胰腺癌組織、血清中的miR-381 呈低表達，其表達量反映了胰腺癌的進展情況，可作為為胰腺癌潛在的腫瘤分子標志物及預后判斷指標，對胰腺癌的臨床診治具有一定的價值。