HPLC-ELSD 法測定3 種廣式?jīng)龉械姆瞪疤?/h1>
2021-04-08 16:53:08張增榜張國列張澤佳黃智興李錦添吳巨賢黃百祺
現(xiàn)代食品 2021年4期
◎ 張增榜，張國列，張澤佳，黃智興，李錦添，吳巨賢，黃百祺
（1.廣東同享食品有限公司，廣東 揭陽 515300；2.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510520；3.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院餐旅學(xué)院，廣東 廣州 510430；4.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院現(xiàn)代嶺南飲食傳承創(chuàng)新研發(fā)廣東省普通高校工程技術(shù)中心，廣東 廣州 510430）
涼果是廣東傳統(tǒng)糖制產(chǎn)品之一，其歷史可追溯到唐宋時期。傳統(tǒng)廣式?jīng)龉?jīng)過鹽腌、脫鹽、漂燙、糖漬和干燥等諸多程序，品質(zhì)正常的廣式?jīng)龉伾r亮、質(zhì)地柔軟，其中糖漬工藝和糖漿的組成是影響其質(zhì)量的重要的環(huán)節(jié)之一[1]。如果糖熬制和糖漬工藝不當(dāng)，產(chǎn)品在生產(chǎn)、貯存和運(yùn)輸過程中表面會出現(xiàn)白色或黃褐色的結(jié)晶糖霜，導(dǎo)致質(zhì)地粗糙變硬、表面失去光澤，此現(xiàn)象稱為“返砂”[2]。涼果“返砂”不僅嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量和企業(yè)形象，而且往往被消費(fèi)者誤認(rèn)為產(chǎn)品發(fā)生了霉變，直接影響其價格，從而影響企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。
“返砂”現(xiàn)象在傳統(tǒng)涼果生產(chǎn)過程中比較常見。研究表明，產(chǎn)品中轉(zhuǎn)化糖的比例對產(chǎn)品的質(zhì)量有重要的影響，蔗糖轉(zhuǎn)化度在30%以下時，涼果容易發(fā)生“返砂”，轉(zhuǎn)化度高于70%容易發(fā)生吸濕“流糖”現(xiàn)象，適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化度（40%～60%）能抑制“返砂”[3]。目前，關(guān)于涼果“返砂”的研究主要在糖漿滲糖工藝[4]、回糖法抑制返砂[5]等方面，而對返砂糖成分的分析較少。水溶性糖的測定方法有化學(xué)法、酶電極法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法和高效液相色譜法等。化學(xué)法適用于還原糖和總糖的測定；酶電極法是一種只針對葡萄糖的分析方法；因糖類物質(zhì)不含發(fā)色官能團(tuán)，利用氣相色譜和液相色譜-紫外檢測法進(jìn)行檢測時，需對其進(jìn)行紫外衍生，操作繁瑣[6]。目前使用較多的是液相色譜-示差折光檢測法，但示差檢測器靈敏度低、穩(wěn)定性差且無法用于梯度洗脫；蒸發(fā)光散射檢測器（Evaporative Light Scattering Detector，ELSD）是一種通用型質(zhì)量檢測器，它對有質(zhì)量的物質(zhì)都能進(jìn)行檢測，特別適合無紫外吸收的糖類物質(zhì)的檢測，靈敏度可達(dá)示差檢測器的10 倍[7]。為深入了解“返砂”的成因，試驗選取情人梅、加應(yīng)子和烏李3 種典型廣式?jīng)龉胺瞪啊碑a(chǎn)品，通過建立高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法（HPLC-ELSD）測定返砂糖的組成和含量，為提升廣式?jīng)龉麄鹘y(tǒng)加工工藝和產(chǎn)品品質(zhì)提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
情人梅、加應(yīng)子、烏李返砂樣品，均由廣東同享食品有限公司提供。
乙腈（色譜純），由美國BCR 公司提供；蔗糖（純度≥99%）、葡萄糖（純度≥99%）、果糖（純度99%），均由上海泰坦科技股份有限公司提供。
1.2 儀器與設(shè)備
Shimadzu 高效液相色譜儀（LC-16 二元泵、CTO-16 柱溫箱、SIL-16 自動進(jìn)樣器與ELSD-LT II 蒸發(fā)光散射檢測器，島津公司）、M204e 型電子天平（梅特勒-托利多公司）、Synergy 型超純水系統(tǒng)（默克密理博公司）。
1.3 色譜條件
色譜柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（70 ∶30，V/V）；流速：1 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；蒸發(fā)光檢測器：載氣為N2，壓力為350 kPa，漂移管溫度為60 ℃。
1.4 試驗方法
1.4.1 對照品溶液配制
精密稱取蔗糖對照品1.001 7 g，葡萄糖對照品1.004 0 g，果糖對照品1.000 6 g，置于100 mL容量瓶中，以純化水溶解并稀釋至刻度，得蔗糖、葡萄糖、果糖質(zhì)量濃度分別為10 mg·mL-1、10 mg·mL-1、10 mg·mL-1的混合對照品溶液。
1.4.2 供試品溶液配制
小心刮取情人梅返砂樣品表面的結(jié)晶糖，精密稱取0.102 6 g，置于10 mL 容量瓶中，以純化水溶解并稀釋至刻度，即得。
1.4.3 系統(tǒng)適用性試驗
吸取混合對照品溶液適量，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液按1.3 色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。
1.4.4 線性關(guān)系考察
分別精密吸取混合對照品溶液1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL 和10.0 mL，置于10 mL 量瓶中，以純化水稀釋至刻度，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液按1.3 色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。分別以蔗糖、葡萄糖和果糖的峰面積為縱坐標(biāo)（y），以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性回歸 方程。
1.4.5 檢出限和定量限
取混合對照品溶液適量用純化水逐級稀釋，按1.3進(jìn)行色譜分析，以3 倍信噪比（S/N=3）的方法計算檢出限（LOD），以10 倍信噪比（S/N=10）的方法計算定量限（LOQ）。
1.4.6 精密度試驗
精密吸取混合對照品溶液10 μL，按1.3 色譜條件進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖，計算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。
1.4.7 穩(wěn)定性試驗
將供試品溶液在室溫下分別放置0 h、4 h、8 h 和12 h 后，精密吸取10 μL，按1.3 色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，計算峰面積的RSD。
1.4.8 重復(fù)性試驗
按1.4.2 方法制備供試品溶液6 份，分別精密吸取10 μL，按1.3 色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，計算峰面積的RSD。
1.4.9 加標(biāo)回收率試驗
精密稱取已知含量的供試品0.1 g，共3 份，以供試品中蔗糖、葡萄糖、果糖含量約80%、100%和120%的比例分別加入3 種糖對照品，按1.4.2 方法制備供試品溶液，按1.3 色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，重復(fù)3 次，計算平均回收率和RSD。
2 結(jié)果與分析
2.1 系統(tǒng)適用性試驗
混合對照品溶液色譜圖見圖1。果糖、葡萄糖和蔗糖在10 min 內(nèi)達(dá)到基線分離，相對保留時間分別為5.814 min、6.952 min 和8.410 min，理論塔板數(shù)均大于5 000，表明該色譜條件對3 種糖的測定有效、適用。
圖1 對照品色譜圖
2.2 線性關(guān)系、檢出限、定量限
根據(jù)峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到3 種糖的線性回歸方程；按3 倍信噪比（S/N=3）的方法計算檢出限（LOD），按10 倍信噪比（S/N=10）的方法計算定量限（LOQ），結(jié)果見表1。結(jié)果表明，在1 ～10 mg·mL-1的濃度范圍內(nèi)，3 種糖的信號響應(yīng)值與濃度線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5。
表1 3 種糖的回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量限表
2.3 精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性實驗
混合對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，果糖、葡萄糖和蔗糖峰面積的RSD分別為0.87%、1.27%和1.03%，表明儀器的精密度良好。混合對照品溶液在0 ～12 h內(nèi)果糖、葡萄糖、蔗糖峰面積的RSD分別為3.63%、2.08%和1.60%，表明3 種糖在測定條件下12 h 內(nèi)穩(wěn)定。6 份供試品溶液中果糖和葡萄糖峰面積的RSD分別為0.41%、0.88%，表明測定方法的重復(fù)性良好。
2.4 加標(biāo)回收率試驗
以情人梅為代表，按供試品中果糖、葡萄糖和蔗糖含量以低（80%）、中（100%）、高（120%）的比例加入3 種糖的對照品，考察加樣回收率，結(jié)果見表2。3 種糖的加樣回收率為95.12%～104.65%，RSD在2.42%～2.94%，表明測定方法過程可控、樣品前處理方法可行。
2.5 樣品測定
選取出現(xiàn)“返砂”現(xiàn)象的3 種涼果產(chǎn)品情人梅、加應(yīng)子、烏李，每種抽取3 個批次進(jìn)行測定，結(jié)果見表3 和圖2。3 種涼果的“返砂”糖中均未檢測到蔗糖，主要為葡萄糖和果糖，其中葡萄糖含量約為果糖的4 ～7 倍。由此推測，造成這幾種涼果“返砂”的原因并非在糖漿熬制時蔗糖轉(zhuǎn)化不夠，而是轉(zhuǎn)化過度導(dǎo)致果脯中轉(zhuǎn)化糖含量過高。一方面導(dǎo)致常溫糖漬時葡萄糖濃度大于其溶解度從而容易產(chǎn)生結(jié)晶附著，另一方面在高溫潮濕季節(jié)容易產(chǎn)生“流糖”，當(dāng)進(jìn)入低溫干燥季節(jié)后，“流糖”在果脯表面結(jié)晶進(jìn)而產(chǎn)生“返砂”[8]，這與廣式?jīng)龉话阍谶M(jìn)入秋冬季節(jié)后才出現(xiàn)“返砂”的規(guī)律一致。
表2 加樣回收率試驗表
圖2 樣品色譜圖
表3 3 種涼果返砂糖檢測結(jié)果表
3 結(jié)論
建立了高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法同時測定涼果“返砂”糖中3 種成分的檢測方法。結(jié)果表明，蔗糖、葡萄糖、果糖在10 min 內(nèi)達(dá)到基線分離，色譜響應(yīng)值在1 ～10 mg·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限分別為0.088 5·L-1、0.081 6·L-1和0.059 6 g·L-1，加標(biāo)回收率在95.12%～104.65%。該方法分析速度快、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、操作簡單，滿足涼果等果蔬糖制品的快速檢測要求。利用該方法對3 種涼果“返砂”糖的成分進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示“返砂”糖主要為葡萄糖和果糖，轉(zhuǎn)化糖含量過高可能是“返砂”的一種原因。
◎ 張增榜，張國列，張澤佳，黃智興，李錦添，吳巨賢，黃百祺
（1.廣東同享食品有限公司，廣東 揭陽 515300；2.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510520；3.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院餐旅學(xué)院，廣東 廣州 510430；4.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院現(xiàn)代嶺南飲食傳承創(chuàng)新研發(fā)廣東省普通高校工程技術(shù)中心，廣東 廣州 510430）
涼果是廣東傳統(tǒng)糖制產(chǎn)品之一，其歷史可追溯到唐宋時期。傳統(tǒng)廣式?jīng)龉?jīng)過鹽腌、脫鹽、漂燙、糖漬和干燥等諸多程序，品質(zhì)正常的廣式?jīng)龉伾r亮、質(zhì)地柔軟，其中糖漬工藝和糖漿的組成是影響其質(zhì)量的重要的環(huán)節(jié)之一[1]。如果糖熬制和糖漬工藝不當(dāng)，產(chǎn)品在生產(chǎn)、貯存和運(yùn)輸過程中表面會出現(xiàn)白色或黃褐色的結(jié)晶糖霜，導(dǎo)致質(zhì)地粗糙變硬、表面失去光澤，此現(xiàn)象稱為“返砂”[2]。涼果“返砂”不僅嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量和企業(yè)形象，而且往往被消費(fèi)者誤認(rèn)為產(chǎn)品發(fā)生了霉變，直接影響其價格，從而影響企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。
“返砂”現(xiàn)象在傳統(tǒng)涼果生產(chǎn)過程中比較常見。研究表明，產(chǎn)品中轉(zhuǎn)化糖的比例對產(chǎn)品的質(zhì)量有重要的影響，蔗糖轉(zhuǎn)化度在30%以下時，涼果容易發(fā)生“返砂”，轉(zhuǎn)化度高于70%容易發(fā)生吸濕“流糖”現(xiàn)象，適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化度（40%～60%）能抑制“返砂”[3]。目前，關(guān)于涼果“返砂”的研究主要在糖漿滲糖工藝[4]、回糖法抑制返砂[5]等方面，而對返砂糖成分的分析較少。水溶性糖的測定方法有化學(xué)法、酶電極法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法和高效液相色譜法等。化學(xué)法適用于還原糖和總糖的測定；酶電極法是一種只針對葡萄糖的分析方法；因糖類物質(zhì)不含發(fā)色官能團(tuán)，利用氣相色譜和液相色譜-紫外檢測法進(jìn)行檢測時，需對其進(jìn)行紫外衍生，操作繁瑣[6]。目前使用較多的是液相色譜-示差折光檢測法，但示差檢測器靈敏度低、穩(wěn)定性差且無法用于梯度洗脫；蒸發(fā)光散射檢測器（Evaporative Light Scattering Detector，ELSD）是一種通用型質(zhì)量檢測器，它對有質(zhì)量的物質(zhì)都能進(jìn)行檢測，特別適合無紫外吸收的糖類物質(zhì)的檢測，靈敏度可達(dá)示差檢測器的10 倍[7]。為深入了解“返砂”的成因，試驗選取情人梅、加應(yīng)子和烏李3 種典型廣式?jīng)龉胺瞪啊碑a(chǎn)品，通過建立高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法（HPLC-ELSD）測定返砂糖的組成和含量，為提升廣式?jīng)龉麄鹘y(tǒng)加工工藝和產(chǎn)品品質(zhì)提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
情人梅、加應(yīng)子、烏李返砂樣品，均由廣東同享食品有限公司提供。
乙腈（色譜純），由美國BCR 公司提供；蔗糖（純度≥99%）、葡萄糖（純度≥99%）、果糖（純度99%），均由上海泰坦科技股份有限公司提供。
1.2 儀器與設(shè)備
Shimadzu 高效液相色譜儀（LC-16 二元泵、CTO-16 柱溫箱、SIL-16 自動進(jìn)樣器與ELSD-LT II 蒸發(fā)光散射檢測器，島津公司）、M204e 型電子天平（梅特勒-托利多公司）、Synergy 型超純水系統(tǒng)（默克密理博公司）。
1.3 色譜條件
色譜柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（70 ∶30，V/V）；流速：1 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；蒸發(fā)光檢測器：載氣為N2，壓力為350 kPa，漂移管溫度為60 ℃。
1.4 試驗方法
1.4.1 對照品溶液配制
精密稱取蔗糖對照品1.001 7 g，葡萄糖對照品1.004 0 g，果糖對照品1.000 6 g，置于100 mL容量瓶中，以純化水溶解并稀釋至刻度，得蔗糖、葡萄糖、果糖質(zhì)量濃度分別為10 mg·mL-1、10 mg·mL-1、10 mg·mL-1的混合對照品溶液。
1.4.2 供試品溶液配制
小心刮取情人梅返砂樣品表面的結(jié)晶糖，精密稱取0.102 6 g，置于10 mL 容量瓶中，以純化水溶解并稀釋至刻度，即得。
1.4.3 系統(tǒng)適用性試驗
吸取混合對照品溶液適量，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液按1.3 色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。
1.4.4 線性關(guān)系考察
分別精密吸取混合對照品溶液1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL 和10.0 mL，置于10 mL 量瓶中，以純化水稀釋至刻度，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液按1.3 色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。分別以蔗糖、葡萄糖和果糖的峰面積為縱坐標(biāo)（y），以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性回歸 方程。
1.4.5 檢出限和定量限
取混合對照品溶液適量用純化水逐級稀釋，按1.3進(jìn)行色譜分析，以3 倍信噪比（S/N=3）的方法計算檢出限（LOD），以10 倍信噪比（S/N=10）的方法計算定量限（LOQ）。
1.4.6 精密度試驗
精密吸取混合對照品溶液10 μL，按1.3 色譜條件進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖，計算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。
1.4.7 穩(wěn)定性試驗
將供試品溶液在室溫下分別放置0 h、4 h、8 h 和12 h 后，精密吸取10 μL，按1.3 色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，計算峰面積的RSD。
1.4.8 重復(fù)性試驗
按1.4.2 方法制備供試品溶液6 份，分別精密吸取10 μL，按1.3 色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，計算峰面積的RSD。
1.4.9 加標(biāo)回收率試驗
精密稱取已知含量的供試品0.1 g，共3 份，以供試品中蔗糖、葡萄糖、果糖含量約80%、100%和120%的比例分別加入3 種糖對照品，按1.4.2 方法制備供試品溶液，按1.3 色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，重復(fù)3 次，計算平均回收率和RSD。
2 結(jié)果與分析
2.1 系統(tǒng)適用性試驗
混合對照品溶液色譜圖見圖1。果糖、葡萄糖和蔗糖在10 min 內(nèi)達(dá)到基線分離，相對保留時間分別為5.814 min、6.952 min 和8.410 min，理論塔板數(shù)均大于5 000，表明該色譜條件對3 種糖的測定有效、適用。
圖1 對照品色譜圖
2.2 線性關(guān)系、檢出限、定量限
根據(jù)峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到3 種糖的線性回歸方程；按3 倍信噪比（S/N=3）的方法計算檢出限（LOD），按10 倍信噪比（S/N=10）的方法計算定量限（LOQ），結(jié)果見表1。結(jié)果表明，在1 ～10 mg·mL-1的濃度范圍內(nèi)，3 種糖的信號響應(yīng)值與濃度線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5。
表1 3 種糖的回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量限表
2.3 精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性實驗
混合對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，果糖、葡萄糖和蔗糖峰面積的RSD分別為0.87%、1.27%和1.03%，表明儀器的精密度良好。混合對照品溶液在0 ～12 h內(nèi)果糖、葡萄糖、蔗糖峰面積的RSD分別為3.63%、2.08%和1.60%，表明3 種糖在測定條件下12 h 內(nèi)穩(wěn)定。6 份供試品溶液中果糖和葡萄糖峰面積的RSD分別為0.41%、0.88%，表明測定方法的重復(fù)性良好。
2.4 加標(biāo)回收率試驗
以情人梅為代表，按供試品中果糖、葡萄糖和蔗糖含量以低（80%）、中（100%）、高（120%）的比例加入3 種糖的對照品，考察加樣回收率，結(jié)果見表2。3 種糖的加樣回收率為95.12%～104.65%，RSD在2.42%～2.94%，表明測定方法過程可控、樣品前處理方法可行。
2.5 樣品測定
選取出現(xiàn)“返砂”現(xiàn)象的3 種涼果產(chǎn)品情人梅、加應(yīng)子、烏李，每種抽取3 個批次進(jìn)行測定，結(jié)果見表3 和圖2。3 種涼果的“返砂”糖中均未檢測到蔗糖，主要為葡萄糖和果糖，其中葡萄糖含量約為果糖的4 ～7 倍。由此推測，造成這幾種涼果“返砂”的原因并非在糖漿熬制時蔗糖轉(zhuǎn)化不夠，而是轉(zhuǎn)化過度導(dǎo)致果脯中轉(zhuǎn)化糖含量過高。一方面導(dǎo)致常溫糖漬時葡萄糖濃度大于其溶解度從而容易產(chǎn)生結(jié)晶附著，另一方面在高溫潮濕季節(jié)容易產(chǎn)生“流糖”，當(dāng)進(jìn)入低溫干燥季節(jié)后，“流糖”在果脯表面結(jié)晶進(jìn)而產(chǎn)生“返砂”[8]，這與廣式?jīng)龉话阍谶M(jìn)入秋冬季節(jié)后才出現(xiàn)“返砂”的規(guī)律一致。
表2 加樣回收率試驗表
圖2 樣品色譜圖
表3 3 種涼果返砂糖檢測結(jié)果表
3 結(jié)論
建立了高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法同時測定涼果“返砂”糖中3 種成分的檢測方法。結(jié)果表明，蔗糖、葡萄糖、果糖在10 min 內(nèi)達(dá)到基線分離，色譜響應(yīng)值在1 ～10 mg·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限分別為0.088 5·L-1、0.081 6·L-1和0.059 6 g·L-1，加標(biāo)回收率在95.12%～104.65%。該方法分析速度快、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、操作簡單，滿足涼果等果蔬糖制品的快速檢測要求。利用該方法對3 種涼果“返砂”糖的成分進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示“返砂”糖主要為葡萄糖和果糖，轉(zhuǎn)化糖含量過高可能是“返砂”的一種原因。
