食品中菌落總數、大腸菌群的檢測技術探討

◎ 范 蕊，王文文，盧 彬，曹雪琴

（新疆維吾爾自治區分析測試研究院，新疆 烏魯木齊 830011）

菌落總數是食品的衛生指標之一，反應食品被細菌污染的程度及衛生質量。菌落總數的測定看似簡單，但由于食品基質復雜，微生物受損傷程度不一，恢復能力不同，所需要的營養要素不同等，要在同等條件下把所有的細菌都培養出來，實屬不易[1]。目前，我國食品微生物菌落總數的檢測主要依據《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》（GB 4789.2—2016）、 《進出口食品中菌落總數計數方法》（SN/T 0168—2015）、 《出口飲料中菌落總數、大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌計數方法 疏水柵格濾膜法》（SN/T 1607—2017）以及《商品化試劑盒檢測方法 菌落總數 方法一》（SN/T 4544.1—2016）。

國際上，美國AOAC 標準中關于菌落總數比較多，主要有《食品化妝品細菌總數螺旋平板法》（AOAC 977.27—1981）、《食品細菌總數濾膜法》（AOAC 986.32—1987）、《食品中細菌總數的Redigel 果膠法》（AOAC 988.18—1990）及《食品中細菌總數的檢測 再水化干膜法》（AOAC 990.12—1994）；加拿大食藥局采用的是《食品菌落總數3M 法》；英國菌落總數等同采用了ISO 4833—2013；我國的標準也是以ISO4833—2013 為基礎，修訂完成的。

大腸菌群是一群革蘭氏陰性、桿狀、無芽孢、兼性厭氧及能發酵乳糖產酸產氣的腸道細菌的總稱。它并非細菌分類學上的命名，也不代表某一種或某一屬的細菌，而是衛生細菌領域用語，特指具有某些特性的一組和糞便污染有關的細菌。這一群細菌主要包括腸桿菌科的埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬（又叫產氣腸桿菌屬，包括陰溝腸桿菌和產期腸桿菌）、克雷伯氏菌屬的一部分和沙門菌屬的第Ⅲ亞屬（能發酵乳糖）的細菌。它們在生化及血清學方面并非完全一致，但都來自糞便，且與腸道病原菌的生活能力接近，故可作為食品、飲水等被糞便污染的間接指標[2]。

大腸埃希氏菌是大腸菌群中的典型種，除大腸埃希氏菌外，大腸菌群的主要成員是產氣腸桿菌和若干檸檬酸桿菌等。食品中糞便含量只要達到10-3mg·kg-1即可檢出大腸菌群[3]。在具體鑒定時，一般規定產酸、產氣的條件是37 ℃下48 h；美國標準規定產氣的條件是35 ℃下48 h；英國的細菌學家進一步規定氧化酶為陰性，在膽鹽或其他表面活性劑存在下能進行好氧或厭氧性生長；而英國乳品微生物學家則除上述要求外，還規定乳糖發酵的溫度為30 ～35 ℃[4]。我國大腸菌群檢測GB 4789.3—2016 是參考ISO 4832—2006 和BAM：Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria（2002）的內容修訂完成，分為MPN 法和平板計數法。

1 試驗材料

1.1 樣品來源

樣品來自中國工業微生物菌種保藏中心（CICC 質控樣：FTQC-03-02 乳粉中的大腸菌群，FTQC-02-02 乳粉中的菌落總數）、中國檢驗檢疫科學研究院（CAIQ質控樣：QC-FD-004 乳粉中的大腸菌群，QC-FD-002 乳粉中的菌落總數）以及新疆維吾爾自治區市場監督管理局（能力驗證樣品：20-A030 乳粉中的菌落總數和大腸菌群，20-E690 乳粉中的菌落總數和大腸菌群）。

1.2 培養基及試劑

平板計數瓊脂培養基（PCA）、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）和月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST），均購自北京陸橋技術股份有限公司；氯化鈉，購自天津市北聯精細化學品開發有限公司；3MPetrifilmTM 試紙片，購自美國3M 公司。

1.3 試驗儀器

IGS400 恒溫培養箱（賽默飛世爾科技公司）、 LDZM-80KCS-2-01-00 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）。

2 試驗方法

2.1 樣品處理方法

操作步驟：無菌開啟西林瓶，立即（1 min 內）加入少量（2 ～4 mL）稀釋液（可以用生理鹽水或磷酸緩沖液）進行再水化，稀釋液合計40 mL，待溶解后，吸出放入無菌瓶中，反復用余下的稀釋液清洗西林瓶內壁，回收清洗液放入上述的無菌瓶中，此溶液即是待測樣品原液（針對定量檢測項目，該40 mL 液體即為待測原液，即100），再按照無菌操作稀釋至10-6。全過程20 min 內完成。將上述制備的40 mL 待測原液按照標準方法GB 4789.2—2016 和GB 4789.3—2016 進行后續試驗。

2.2 2 種不同來源的質控樣對比

將CICC 和CAIQ 的質控樣品，按GB 4789.2—2016 標準方法檢測菌落總數，觀察不同培養時間對兩種質控樣品菌落計數結果的影響。

2.3 2 種不同方法對能力驗證樣品中菌落總數的測定比較

將新疆維吾爾自治區市場監督管理局的能力驗證樣品，分別采用平板計數法和3M 試紙法測定菌落總數，每個樣品做6 個平行，取平均值，同時用質控樣作為參照。

2.4 3 種不同方法對能力驗證樣品中大腸菌群數的測定比較

將新疆維吾爾自治區市場監督管理局的能力驗證樣品，參照GB 4789.3—2016，分別采用MPN 法、平板計數法和3M 試紙法進行測定大腸菌群，每個樣品做雙平行試驗，每組試驗各設2 個空白對照，同時用質控樣作為參照。

3 結果與分析

3.1 不同培養時間對菌落總數計數結果的影響

樣品分別來自CICC 和CAIQ 質控樣品，按 GB 4789.2-2016 標準方法檢測，觀察不同培養時間對兩種質控樣品菌落計數結果的區別，試驗結果見表1。

表1 不同培養時間對菌落總數計數結果的影響表 （單位：CFU·g-1）

如表1 結果所示，CICC 的樣品培養24 h 和培養48 h 計數結果差別不大，24 h 時有少量的菌落較小，計數時可能會有遺漏，造成結果偏小。CAIQ 的樣品培養24 h 計數結果與標準值差別不大，培養48 h 后由于平板上有大量的片狀菌，直徑為1 ～2 cm，大量的片狀菌將24 h可以明顯觀察到的菌落形態較小的菌（直徑為0.5 ～1 mm）全部覆蓋，基本不能計數[5]。我國國家標準規定，除水產品外，菌落總數的計數時間為48 h，不同的樣品培養時間不能一概而論，培養24 h時應對菌落先進行一次預計數，培養48 h 時再對其進行一次計數，若48 h 計數時沒有片狀菌落的計數干擾以48 h 計數結果為準。若48 h 時菌落形態依然很小，肉眼難以計數，說明樣品中的菌落有可能屬于休眠或受損狀態，應延長培養時間至72 h 再計數。

3.2 菌落總數兩種檢測方法的對比

如表2 所示，使用3M 試紙檢測結果值總體上要比使用平板計數法得到的值低，但結果值與質控值接近，說明3M 試紙用于食品的快速檢測檢驗結果比較可靠。

表2 菌落總數2 種檢測方法的對比表（單位：CFU·g-1）

3.3 大腸菌群3 種檢測方法的對比

樣品為來自新疆維吾爾自治區市場監督管理局的能力驗證樣品，試驗空白對照大腸菌群數均為零，檢測結果見表3。

表3 大腸菌群3 種檢測方法的對比表

如表3 所示，3 種檢測方法對比之后，MPN 法結果值與質控標準值接近，說明MPN 法選擇性高，與平板計數法之間無明顯差異，相比較而言，3M 試紙片法方便快捷，可在檢測實驗中作為對照或參考。

4 結論與討論

菌落總數在進行能力驗證時，應充分考慮樣品中可能會添加的蔓延菌和生長遲緩細菌，因此在培養時間和觀察上應該注意，必要的時候加入三苯基氯化四氮唑（TTC），或覆蓋一層培養基來有效抑制菌體蔓延[6]。培養基中若要加TTC，計數平板不得超過 300 CFU·g-1，否則平板上的菌落會呈色減弱或不呈色[7]。有時為了區分樣品和菌落可采用冷培養平板作為對照。另外，培養基傾注的溫度與厚度是實驗正確與否的關鍵，溫度過高會造成已受損傷的菌細胞死亡，若培養基太薄，在培養過程中可能因水分蒸發而影響細菌的生長。應注意每遞增稀釋一次，必須另換一支吸管，以保證樣品稀釋倍數的準確性。

大腸菌群MPN 法初發酵實驗，對于產酸未產氣的發酵管，可以用手輕輕拍打試管，如果有氣泡沿著管壁上升，應考慮可能有氣體產生。這種情況在初發酵時，容易產生，此時可能會受到試管內小倒管管口完整性、小倒管外是否有沉渣等影響，應進一步做驗證實驗[8]。大腸菌群中典型菌落主要包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產氣克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌，建議檢驗人員初次實驗時取這4 種細菌進行陽性對照試驗，注意觀察并記錄典型大腸菌群形態，區分出典型菌落和可疑菌落。

此外，在菌落總數和大腸菌群計數時，還可能出現高稀釋倍數培養皿細菌數與低稀釋倍不成10 倍關系，或高稀釋倍數培養皿細菌數高于低稀釋倍數[9-10]，這可能是檢驗過程操作有誤或者樣品中還含有防腐劑，此時的計數結果不應作為檢測報告的依據。