不同認知障礙大鼠模型造模效果比較

李肇蕤 李孟知 程子娟 曹 娜 劉漫君 朱 琳 夏春波

1.桂林醫學院基礎醫學院人體解剖學教研室，廣西桂林 541004；2.桂林醫學院附屬醫院新生兒科，廣西桂林 541001；3.桂林醫學院附屬醫院病理科，廣西桂林 541001

阿 爾茲海默 病（Alzheimer's disease，AD）是一種復雜的神經系統退行性疾病，通常會導致包括學習和記憶在內的認知功能的嚴重損害，全球受到其影響的人超過4000 萬，并且預計未來幾十年內會呈指數級增長，但其發病機制尚未完全清楚[1-3]。為開展AD 相關研究，眾多學者嘗試了各種模式生物，目前雖已有多種認知障礙動物模型造模方法[4-6]，但各有優缺點。選擇合適的認知障礙動物模型是AD 實驗研究的重要組成部分，為此本研究利用Morris 水迷宮系統對三種不同認知障礙大鼠模型的造模效果進行比較，為認知障礙動物研究提供更客觀、可靠的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

45 只健康成年雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，體重200～300 g，均由桂林醫學院SPF級動物實驗中心提供，合格證號：SCXK 桂2007-0001。在實驗開始前運用Morris 水迷宮系統進行篩選，剔除游泳障礙、原地旋轉與靜止不動的大鼠后剩余40 只，隨機將其分為檸檬酸鋁組、亞硝酸鈉組、鈉鋁聯合注射組與對照組，每組各10 只。環境溫度為22～26 ℃，自然晝夜節律。大鼠自由進食、飲水，所有實驗均符合動物倫理標準，獲得桂林醫學院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與設備

檸檬酸鋁、亞硝酸鈉均購自源葉生物科技有限公司，Morris 水迷宮系統（XR-XM101，上海欣軟）。

1.3 認知障礙模型建立

各組大鼠稱量體重后，檸檬酸鋁組腹腔注射5% 檸檬酸鋁水溶液，劑量為120 mg/kg。亞硝酸鈉組腹腔注射3% 亞硝酸鈉水溶液，劑量為30 mg/kg。鈉鋁聯合注射組以相同的劑量同時腹腔注射以上兩種試劑。以上三組均隔天給藥，共持續60 d，并隨體重變化調整藥物注射量。對照組未施加任何干擾因素，各組大鼠給予充足的食物與水。

1.4 認知障礙模型學習記憶能力評價

給藥60 d 后利用Morris 水迷宮進行學習記憶能力檢測。定位航行實驗：實驗共持續4 d，每天進行4 次，每次間隔3 min。透明逃生平臺被放置在圓形游泳池第四象限水下，記錄大鼠分別從4 個象限入水點入水到爬上平臺所需的時間（逃避潛伏期），若大鼠120 s 內沒有爬上平臺，則將逃避潛伏期記錄為120 s 并將大鼠置于平臺上停留15 s 以熟悉位置，計算每天平均逃避潛伏期。空間探索實驗：于定位航行實驗結束后第5 天進行。在此實驗中撤去逃生平臺，大鼠于原平臺所在象限的對側象限入水，記錄120 s 內大鼠跨越原平臺所在位置的次數。平均逃避潛伏期、跨越原平臺所在位置的次數兩項指標與對照組比較差異均有統計學意義，則判定為學習記憶功能障礙。

表1 定位航行實驗中各組大鼠平均逃避潛伏期（，s）

表1 定位航行實驗中各組大鼠平均逃避潛伏期（，s）

注：與對照組比較，*LSD-t=5.195，*P ＜0.05；#LSD-t=3.998，#P ＜0.05

1.5 統計學分析

應用SPSS 22.0 統計學軟件與Graphpad Prism 8.0 軟件對實驗結果進行分析作圖。計量資料以（）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析（ANOVA），進一步兩兩比較運用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 定位航行實驗結果

隨著實驗天數的增加，各組大鼠逃避潛伏期逐漸縮短。第3 天起，與對照組比較，鈉鋁聯合注射組大鼠平均逃避潛伏期顯著延長，差異有統計學意義（P＜0.05），檸檬酸鋁組與亞硝酸鈉組平均逃避潛伏期與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），提示檸檬酸鋁組與亞硝酸鈉組大鼠仍有較強的學習獲取能力，而鈉鋁聯合注射組大鼠學習獲取能力較差。見表1、圖1～2。

2.2 空間探索實驗結果

與對照組比較，鈉鋁聯合注射組大鼠跨越原平臺位置次數顯著減少，差異有統計學意義（P＜0.05），檸檬酸鋁組和亞硝酸鈉組跨越原平臺位置次數與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），提示檸檬酸鋁組大鼠與亞硝酸鈉組大鼠空間記憶能力未有明顯改變，而鈉鋁聯合注射組大鼠空間記憶能力減弱。見表2、圖1～2。

表2 空間探索實驗各組大鼠跨越平臺次數（，次）

表2 空間探索實驗各組大鼠跨越平臺次數（，次）

注：與對照組比較，*LSD-t=3.211，*P ＜0.05

圖1 各組大鼠Morris 水迷宮實驗結果

圖2 各組大鼠Morris 水迷宮游泳軌跡

3 討論

海馬作為中樞邊緣系統的一部分，其結構與學習記憶功能密切相關，AD 早期最主要的表現是學習記憶能力的下降[7-8]。Morris 水迷宮是評價動物學習記憶的經典方法，在AD 動物模型的研究領域中被廣泛運用[9-10]。大鼠與一般動物相比，具有繁殖能力強、生存率高、易于飼養等優點，有利于進行大樣本的實驗研究，同時又具有較強的快速學習能力，是目前最廣泛用于AD 模型制備的動物[11-13]。

本實驗通過腹腔注射相應試劑的方式建立認知障礙大鼠模型，結果顯示，與對照組比較，鈉鋁聯合注射組大鼠逃避潛伏期時間延長、跨越平臺次數減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。單純注射檸檬酸鋁或亞硝酸鈉組的大鼠逃避潛伏期、跨越平臺次數與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。人體的生長及大腦發育都離不開金屬元素的作用[14]，金屬離子長期處于異常水平時可導致大腦缺氧從而導致嚴重的腦外傷[15-17]。研究表明，金屬鋁與認知障礙發生關系最為密切，鋁導致的學習與記憶能力下降主要與線粒體、內質網損傷和多種蛋白功能障礙有關[18-20]。亞硝酸鈉會導致腦缺氧、神經遞質濃度失衡以及神經元壞死[21-23]。本實驗檸檬酸鋁與亞硝酸鈉聯合注射取得了良好的造模效果，推測可能與鈉鋁聯合作用導致的腦內神經遞質濃度失衡、海馬組織功能受損有關。

綜上所述，大鼠腹腔聯合注射檸檬酸鋁和亞硝酸鈉的造模方法較好的模擬了AD 的病理改變，結果顯示大鼠有明顯的學習記憶功能障礙，造模效果優于單獨腹腔注射檸檬酸鋁或亞硝酸鈉，操作簡便，可重復性強，是較為理想的認知障礙大鼠模型。