外泌體長鏈非編碼RNA在胰腺癌發(fā)病機(jī)制及分子診斷中的研究進(jìn)展

萬 君 崔 潔 焦曙光 趙 雙 劉 敏 李青桐 柯 紅

1.三峽大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院 國藥葛洲壩中心醫(yī)院藥學(xué)部，湖北宜昌 443002;

2.三峽大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院 國藥葛洲壩中心醫(yī)院腫瘤科，湖北宜昌 443002

胰腺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的消化系統(tǒng)疾病之一，處于癌癥患者死亡率的第四位，其總體五年生存率小于5%，并且這一數(shù)據(jù)在將近50年內(nèi)保持不變[1]。作為“癌中之王”，胰腺癌具有高擴(kuò)散性、易耐藥性、嗜神經(jīng)性、低預(yù)后性和低存活率等特點(diǎn)[2]。近年來，臨床及基礎(chǔ)科研從不同水平和角度對(duì)胰腺癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行探討，取得的相關(guān)研究成果極大地促進(jìn)了人們對(duì)胰腺癌的認(rèn)識(shí)，然而目前對(duì)調(diào)控胰腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥、診斷等分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍然十分有限。

以往傳統(tǒng)的生物學(xué)標(biāo)志，如CA19-9 敏感性和特異性分別為70%～85% 和65%～80%，在胰腺癌的診斷和預(yù)后上缺乏很好的敏感性和特異性。因此，尋找胰腺癌發(fā)生發(fā)展、早期診斷及預(yù)后相關(guān)的新的生物學(xué)標(biāo)記物，對(duì)早期發(fā)現(xiàn)胰腺癌并改善胰腺癌預(yù)后有重要意義。

1 外泌體在胰腺癌耐藥機(jī)制及分子診斷中的研究進(jìn)展

外泌體（exosome）是一種直徑為50～200 nm的納米級(jí)雙層脂質(zhì)包裹體結(jié)構(gòu)，可攜帶母體細(xì)胞特征性生物信息分子，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、脫氧核糖核酸（DNA）、信使RNA（mRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）以及非編碼RNA（non-coding RNA）等生物學(xué)信息，廣泛存在于體液中，包括血液、眼淚、尿液、唾液、乳汁、腹水等[3]。外泌體可作為細(xì)胞間運(yùn)輸載體將生物分子傳遞給其他細(xì)胞，參與多種生物學(xué)行為。研究表明，相對(duì)于正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞可以分泌更多的外泌體，通過分析外泌體可以直接獲得癌細(xì)胞的基本信息[4]。外泌體參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的多種過程，包括促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和產(chǎn)生耐藥以及引起腫瘤微環(huán)境的改變[5]。

來自Nature 的一項(xiàng)研究結(jié)果提示，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1（GPC1）循環(huán)外泌體（crExos）可以作為一種潛在非侵入性診斷和篩查工具的組成部分，用來檢測(cè)有可能處于適合手術(shù)治療階段的早期胰腺癌[6]。另一項(xiàng)來自Nature 的研究提示，外泌體在靶向KRAS 治療胰腺癌上發(fā)揮著重要作用。在胰腺癌的多種小鼠模型中，通過iExosomes 的治療可以抑制腫瘤，并顯著增加總生存期。該研究結(jié)果表明使用iExosomes 是一種特異性靶向癌基因KRAS的方法，從而治療胰腺癌[7]。

Yang 等[8]證明了循環(huán)外泌體DNA 在胰腺相關(guān)病變，包括胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic duct adenocarcinoma，PDAC），慢性胰腺炎和胰腺炎相關(guān)病變中鑒定KRASG12D 和TP53R273H 突變的潛在臨床效用，循環(huán)外泌體DNA 對(duì)快速、低成本鑒定癌癥突變因子具有重要價(jià)值。

Costa-Silva 等[9]發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）在PDAC 衍生的外泌體中高表達(dá)，抑制其表達(dá)可阻斷肝轉(zhuǎn)移前的生態(tài)位形成和轉(zhuǎn)移。與胰腺腫瘤無進(jìn)展的患者相比，外泌體中MIF 明顯高于Ⅰ期PDAC 患者，而后者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。這些研究結(jié)果表明外泌體MIF 可引起肝臟轉(zhuǎn)移，可能是PDAC肝轉(zhuǎn)移發(fā)展的預(yù)后指標(biāo)。

在腫瘤耐藥機(jī)制方面，外泌體也發(fā)揮著重要作用。Richards 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，暴露于吉西他濱下的癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）能顯著增加細(xì)胞外的外泌體囊泡的釋放。通過外泌體釋放抑制劑GW4869 處理吉西他濱暴露的CAF 能顯著降低共培養(yǎng)上皮細(xì)胞的存活率，表明CAF 外泌體在化療藥物耐藥性中發(fā)揮了重要作用，提示外泌體抑制劑在胰腺癌的治療及克服化療藥物耐藥性中具有重要潛力。

Patel 等[11]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過外泌體遞送的miR-155 可使吉西他濱代謝基因（DCK）下調(diào)，而當(dāng)miR-155 的功能受到抑制或DCK 恢復(fù)時(shí)，通過吉西他濱處理的胰腺癌細(xì)胞（Gem-CM）耐藥性將顯著降低。這些研究表明外泌體在介導(dǎo)胰腺癌獲得性耐藥性的過程中發(fā)揮了重要作用。

總之，外泌體作為具有生物學(xué)功能的小囊泡，內(nèi)容物豐富、穩(wěn)定性高，具有一定的組織特異性，是近年腫瘤研究領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)，上述研究進(jìn)展說明外泌體在胰腺癌疾病發(fā)展過程中具有重要作用。

2 長鏈非編碼RNA在胰腺癌發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展

長鏈非編碼RNA（long non coding RNA，lncRNA），是一類長度超過200 個(gè)核苷酸，無蛋白質(zhì)編碼功能的RNA 分子，通常由RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成[12]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA 參與腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移、凋亡等過程。

多項(xiàng)研究結(jié)果表明lncRNA 與胰腺癌發(fā)生、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥性有著重要的關(guān)系。lncRNA可以介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生，通過調(diào)節(jié)表觀遺傳修飾，選擇性剪接、增殖、遷移和轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯。目前研究較多的信號(hào)通路見圖1。

圖1 lncRNAs 在胰腺癌進(jìn)展中的分子機(jī)制[13]

Li 等[14]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢測(cè)了33 對(duì)癌組織和非癌組織中l(wèi)ncRNA NORAD 的表達(dá)。結(jié)果表明lncRNA NORAD 可能通過競(jìng)爭(zhēng)hsamir-125a-3p 來調(diào)節(jié)小GTP 結(jié)合蛋白rhoa 的表達(dá)，這一發(fā)現(xiàn)有助于更好地理解lncRNas 在缺氧誘導(dǎo)的EMT 中的作用，并為胰腺癌提供一個(gè)潛在的新的診斷和治療靶點(diǎn)。

Li 等[15]通過對(duì)lncRNAS 和mRNAS 進(jìn)行的微陣列聯(lián)合分析表明，lncRNA-NUTF2P3-001 在胰腺癌和慢性胰腺炎組織中過表達(dá)，且與KRAS mRNA表達(dá)呈正相關(guān)。下調(diào)lncRNA-NUTF2P3-001 后，伴隨著KRAS 表達(dá)的降低，胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲在體內(nèi)外均受到顯著抑制。來自胰腺癌患者的數(shù)據(jù)同樣顯示lncRNA-NUTF2P3-001 與KRAS 之間呈正相關(guān)。該研究為腫瘤致癌基因KRAS 提供了新的lncRNA 介導(dǎo)的調(diào)節(jié)機(jī)制，并暗示lncRNANUTF2P3-001 和miR-3923 可用作胰腺癌的新型預(yù)測(cè)因子和治療靶標(biāo)。

Liu 等[16]臨床研究結(jié)果表明，與鄰近的正常胰腺組織相比，PDAC 中l(wèi)ncRNA MALAT1 的 相對(duì)水平顯著升高，同樣在aspc-1 PDAC 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT1 的表達(dá)顯著增高。lncRNA MALAT1 表達(dá)水平與腫瘤大小，腫瘤分期和侵襲深度顯著相關(guān)。多變量分析表明，lncRNA MALAT1的過表達(dá)以及腫瘤位置和神經(jīng)侵襲是PDAC 疾病特異性存活的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。說明lncRNA MALAT1是一種潛在的預(yù)后指標(biāo)，可能成為PDAC 診斷和基因治療的靶點(diǎn)。

Sun 等[17]采用逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)，檢測(cè)原發(fā)性胰腺癌組織中LncRNA HMlincRNA717 的表達(dá)，并分析了HMlincRNA717 與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。多變量分析顯示，HMlincRNA717表達(dá)下降是胰腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立因素。lncRNA HMlincRNA717 的表達(dá)在胰腺癌中下調(diào)并與總體存活相關(guān)，表明HMlincRNA717 可能是胰腺癌進(jìn)展的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物。

Wei 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-XIST 在胰腺癌組織和細(xì)胞系中特異性上調(diào)，胰腺癌中l(wèi)ncRNAXIST 的高表達(dá)與較差的預(yù)后相關(guān)。lncRNA-XIST和miR-133a 在PC 細(xì)胞中相互抑制，而外源miR-133a表達(dá)顯著抑制PC 細(xì)胞增殖。此外，miR-133a 可直接與XIST 和EGFR 的30UTR 靶向結(jié)合。在PC組織中，miR-133a 表達(dá)下調(diào)，EGFR 表達(dá)上調(diào)；miR-133a 分別與EGFR 和XIST 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；XIST 與EGFR表達(dá)呈正相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)闡明XIST/miR-133a/EGFR在調(diào)節(jié)PC 細(xì)胞增殖中的作用和機(jī)制，表明 XIST 可能成為未來PC 的潛在治療靶點(diǎn)。

此外，還有研究[19]結(jié)果表明lncRNA 參與了胰腺癌的多種耐藥機(jī)制，針對(duì)特定lncRNA 的療法可能有助于克服其耐藥性。提示靶向lncRNA 可能是一種新的策略，為胰腺癌的患者提供更好的治療效果。

3 lncRNA在胰腺癌分子診斷中的研究進(jìn)展

除發(fā)病機(jī)制外，在早期診斷方面，lncRNA 也同樣發(fā)揮了重要作用。鑒于lncRNAs 在體液中循環(huán)時(shí)具有很高的穩(wěn)定性，特別是當(dāng)lncRNAs 被包含在外泌體或凋亡小體中時(shí)，這些優(yōu)勢(shì)使得它們適合作為癌癥診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物[20]。

在原發(fā)腫瘤組織中l(wèi)ncRNA 的失調(diào)在各種體液中都有明顯的體現(xiàn)，包括全血、血漿、尿液、唾液和胃液[21]。這些特征性的lncRNA 標(biāo)志物與常規(guī)活檢相比具有微創(chuàng)性，更容易被患者接受。因此，開發(fā)有效和便利的基于lncRNA 的生物標(biāo)志物的檢測(cè)手段，檢測(cè)外泌體中的循環(huán)癌癥相關(guān)lncRNAs 可用于評(píng)估早期階段的腫瘤患者或健康人群中潛在的癌癥風(fēng)險(xiǎn)，并具有一定的高敏感性和特異性。此外，也可以評(píng)估腫瘤患者的預(yù)后以及手術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)和手術(shù)成功率。對(duì)于Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌患者，lncRNA MALAT1 已經(jīng)被證實(shí)可以作為有效預(yù)后參數(shù)[22-23]。在前列腺癌診斷中，尿液樣本中l(wèi)ncRNA PCA3 的指標(biāo)與廣泛使用的血清中前列腺特異性抗原（PSA）相比有著更高的準(zhǔn)確率[24]。LncRNA RP11-445H22.4 在乳腺癌組織中高表達(dá)，將其作為檢測(cè)具有高靈敏度（92%）和特異性（74%），并且明顯優(yōu)于乳腺癌診斷的常規(guī)生物標(biāo)志[25]。由于某些lncRNAs 僅存在于胃癌患者中，并在不同腫瘤分期（早期到轉(zhuǎn)移期）含量不同，因此通過檢測(cè)胃癌患者體液樣品（血漿和胃液）中的lncRNA TINCR、CCAT2、AOC4P、BANCR、LINC00857、AA174084和H19 水平可作為評(píng)估胃癌的標(biāo)志物[26]。

綜上所述，lncRNA 可從多個(gè)層面調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為，與胰腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。上述研究結(jié)果均提示，lncRNA 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用，隨著基因芯片和高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，新型 lncRNA 分子的發(fā)現(xiàn)將為腫瘤的早期診斷提供新的視角。

4 問題與展望

綜合國內(nèi)外研究進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)外泌體及l(fā)ncRNA在胰腺癌疾病的發(fā)展及耐藥機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。盡管關(guān)于該領(lǐng)域的相關(guān)研究較多，與lncRNA相關(guān)的部分信號(hào)通路已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但尚有許多未知的發(fā)病機(jī)制沒有被闡明，尤其是在胰腺癌患者早期篩查及分子診斷方面還需深入研究。以胰腺癌外泌體中l(wèi)ncRNA 作為研究對(duì)象，借助現(xiàn)代分子生物學(xué)及生物信息學(xué)、分子藥理學(xué)等手段，檢測(cè)出外泌體中含量較高的lncRNA，通過分子、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等證明這些外泌體中l(wèi)ncRNA 在胰腺癌進(jìn)展中的作用機(jī)制以及分子診斷工具的開發(fā)具有一定的意義。為闡明外泌體中l(wèi)ncRNAs 在胰腺癌發(fā)病機(jī)制中的重要作用及新的信號(hào)通路的發(fā)現(xiàn)提供理論依據(jù)，為胰腺癌患者的分子診斷和靶向治療提供實(shí)驗(yàn)支撐。進(jìn)一步揭示外泌體中l(wèi)ncRNAs 對(duì)胰腺癌發(fā)生、發(fā)展、治療、預(yù)后的影響作用，可為胰腺癌的預(yù)防、治療、預(yù)后評(píng)價(jià)等找到新的突破口。