HPLC法測定不同產地醋莪術飲片中姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素的含量

高紅寧 殷 奕 毛春芹 陸兔林

1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京 210046；2.南京多康商貿有限公司，江蘇南京 210000

中藥莪術為姜科植物溫郁金C.wenyujin Y.H.Chen et C.Ling、廣西莪術C.kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang和蓬莪術C.phaeocaulis Valeton的干燥根莖，味辛、苦，性溫，歸肝、脾經，具有消積止痛、行氣破血的功效[1]。莪術主要有效成分為揮發油和姜黃素類[2-11]。其中姜黃素類成分主要為姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素。姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素具有明顯的體外抗凝血與抗血栓的活性[12-16]。在中醫臨床上應用較多的是醋莪術飲片，但有關醋莪術飲片的研究報道較少；本實驗首次對醋莪術飲片中姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素的含量進行同時測定，能更好地控制醋莪術飲片質量，可為制定醋莪術飲片質標提供技術手段。

1 材料

1.1 儀器

1100 型HPLC 儀（美國安捷倫公司）；KH-300DB 型超聲清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；Mettler AG285 電子分析天平 （瑞士梅特勒-托利多集團）；FA210N 電子天平（上饒市鴻翔實業有限公司）；40-B型高速萬能粉碎機（常州邁順機械有限公司）。

1.2 試藥

姜黃素對照品（DST180111-014）；去甲氧基姜黃素對照品（DST181220-030）；雙去甲氧基姜黃素對照品（DST181220-021）；以上對照品均購自成都德斯特生物技術有限公司。莪術樣品購自我國廣西省、浙江省、四川省，經南京中醫藥大學藥學院潘金火教授鑒定為姜科植物溫郁金C.wenyujin Y.H.Chen et C.Ling、廣西莪術C.kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang和蓬莪術C.phaeocaulis Valeton的 干燥根莖。取各產地莪術樣品按《中華人民共和國藥典》2015年版[1]莪術項下自制得醋莪術飲片。表1 為莪術樣品批號、產地和來源。甲酸、乙腈為色譜純（美國Fish 公司），其他溶劑均為分析純。

表1 莪術批號產地和來源

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent pro shell C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相： 0.5‰甲酸水（A）-0.5‰甲酸乙腈（B），梯度洗脫：0～10 min，65%～55%A；10～20 min，55%～30%A；20～25 min，30%～5%A；25～30 min，5%A；30～35 min，5%～60%A；35～40 min，60%A；流速：1.0 ml/min；進樣量：10 μl；檢測波長：415 nm；柱溫：30℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的配制 取3 種對照品適量，精密稱定，置于同一5 ml 量瓶中，加甲醇溶解定容，制得含姜黃素0.071 mg/ml、去甲氧基姜黃素0.051 mg/ml、雙去甲氧基姜黃素0.011 mg/ml 的混合對照品貯備液。

2.2.2 供試品溶液的配制 精密稱定0.5 g 醋莪術飲片粉末，置于50 ml 量瓶中，加入20 ml 70%乙醇，稱定質量，超聲提取30 min，補足減失質量，用微孔濾膜（孔徑為0.45 μm）過濾，所得的濾液作為供試品溶液。

2.3 專屬性試驗

取供試品溶液、混合對照品貯備液，按上述色譜條件測定進樣，記錄色譜，詳見圖1，由圖1 可知，姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素分離良好，在各出峰處均無干擾，表明該方法的專屬性良好。

圖1 高效液相色譜圖

2.4 標準曲線及線性范圍

精密吸取混合對照品貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.5 ml，分別置于5 ml 量瓶內，加甲醇稀釋至刻度，分別精密吸取10 μl 注入HPLC 儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積。以峰面積積分值（Y）為縱坐標，對照品質量濃度（X）為橫坐標，進行線性回歸，得到各對照品線性方程、相關系數及線性范圍見表2。

表2 對照品的標準曲線、相關系數及線性范圍

2.5 精密度試驗

精密吸取對照品溶液按上述色譜條件，于1 d連續進樣，記錄峰面積。結果顯示姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素的峰面積RSD值分別為0.61%、1.13%、0.94%。

2.6 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h 時，按上述色譜條件進行測定，記錄峰面積。結果姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素峰面積的RSD 分別為0.3%、0.8%、0.6%，表明供試品溶液在24 h 內穩定。

2.7 重復性試驗

取批號為SC180211 的醋莪術飲片粉末0.5 g，共6 份，精密稱定，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素的RSD 值，結果分別為1.0%、1.8%、1.0%。

2.8 加樣回收率試驗

取批號為SC180211 的醋莪術飲片粉末0.25 g，精密稱定，共9 份，置于具塞錐形瓶中，分別加入低、中、高3 個質量濃度的混合對照品溶液0.8、1.0、1.2 ml，按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，進樣測定，計算加樣回收率。結果姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素的平均回收率分別為99.2%、97.7%、96.9%，RSD 分別為1.0%、1.2%、1.9%。

2.9 樣品含量測定

取不同產地的醋莪術飲片適量，粉碎，過三號篩，取粉末0.5 g，精密稱定，按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進樣測定3 種成分的量，結果見表3。

表3 不同產地醋莪術中各成分的含量測定結果（n=3）

3 討論

3.1 色譜柱選擇

本實驗考察了Agilent pro shell C18色譜柱和Kromasi C18色譜柱，發現采用Agilent pro shell C18色譜柱，3 種成分均能出峰，各峰間分離度、對稱性好，分離效果為佳。

3.2 色譜條件選擇

本研究依次考察了乙腈-水、乙腈-甲酸水、甲酸乙腈-甲酸水，結果表明0.5‰甲酸水（A）-0.5‰甲酸乙腈（B），0～10 min，65%～55A；10～20 min，55%～30%A；20～25 min，30～5%A；25～30 min，5%A；30～35 min，5%～60%A；35～40 min，60%A；流速1.0 ml/min；柱溫30℃；檢測波長415 nm時分離效果最佳。

3.3 提取條件選擇

在選擇供試品提取方法時，考察了乙醇回流提取法和乙醇超聲提取法，發現兩者的提取效率接近，但乙醇超聲提取節省時間，操作簡便，故選擇乙醇超聲提取法。在乙醇超聲提取的基礎上，分別考察50%、60%、70%、80%乙醇不同提取溶劑；30、40、50、60 min 不同提取時間；25、40、55、70 倍量液料比，確定最佳提取方法為70%乙醇40 倍量超聲提取30 min。

表3 結果表明，不同產地醋莪術中姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素的含量存在差異，總體上四川產醋莪術中姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素含量較高，浙江產醋莪術中未檢出雙去甲氧基姜黃素，姜黃素和去甲氧基姜黃素含量次之，而在廣西產醋莪術中測不到姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素含量。同產地不同時期醋莪術中姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素的含量也有差別，這可能與氣候、光照、溫度、降雨量及加工方法等因素有關，或由于本實驗收集批次較少，樣品存在差異所致。相關研究有待于進一步開展。

本研究建立了HPLC 法測定不同產地醋莪術飲片中姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素的含量方法，確定以70%乙醇為提取液，40 倍量超聲提取 30 min，色譜柱為Agilent pro shell C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.5‰甲酸水-0.5‰甲酸乙腈，梯度洗脫；流速1 ml/min；柱溫30℃；檢測波長415 nm；進樣量10 μl。姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素分別在1.42～71.00、0.22～10.82、1.01～50.50 μg/ml 時與色譜峰面積線性關系良好，平均回收率分別為99.2%、96.9%、97.7%，RSD 分別為1.0%、1.9%、1.2%，該方法準確、靈敏。

目前在中醫臨床上應用較多的是醋莪術飲片，但有關醋莪術飲片的研究報道較少，對莪術的研究多集中在生藥、生飲片和揮發油方面，本實驗采用HPLC 法梯度洗脫首次對醋莪術飲片中姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素的含量進行同時測定，并對不同產地醋莪術中姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素的含量進行比較，實驗方法準確、快速、重復性好，可作為評價醋莪術中姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素等成分的可靠分析方法，能更好地控制醋莪術飲片質量，旨在為制定醋莪術飲片質量標準提供理論依據。