正交試驗法優選復方天麻控釋膠囊的提取工藝研究

楊瑞虹 任建萍 智翠梅

1.山西衛生健康職業學院藥學院，山西太原 030012；2.太原科技大學化學與生物工程學院，山西太原 030021

復方天麻控釋膠囊由天麻、鉤藤、白芍和梔子等12 味中藥組成，為天麻鉤藤飲的改進處方，中醫臨床使用結果表明本方具有清熱安神、平肝熄風等功效，適用于肝陽上亢、肝風內擾型頭痛、失眠及眩暈等癥[1-3]。將該處方采用適宜的方法提取，并采用現代控緩釋技術，制成控釋膠囊，達到延長藥效的作用，有利于長期頭痛、失眠患者服用[4]。處方中君藥為天麻，主要生物活性成分是天麻素（gastrodin），其結構（對羥甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷）中含有多個羥基和苷鍵，極性較大，易溶于水、乙醇、甲醇等極性溶媒，據文獻報道[5-11]，天麻既可用水提取，也可采用一定濃度的乙醇提取，但乙醇提取效果較好，可保證有效成分的穩定性。處方中其他有效成分鉤藤堿、芍藥苷及梔子苷的溶解性與天麻素相似，均可溶解于乙醇，故天麻與其他藥材可采用適宜濃度乙醇進行提取。本試驗以天麻素含量和提取物出膏率的綜合評分為指標，采用高效液相色譜法測定天麻素含量，參照2015年版《中華人民共和國藥典》方法[12]測定提取物出膏率，采用正交試驗法對復方天麻控釋膠囊的提取工藝進行研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；KQ-200VDB 型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Fw177 型中藥材粉碎機（杭州艾普儀器設備有限公司）。

1.2 藥材與試藥

天麻、鉤藤、白芍、梔子等藥材均購自山西和仁堂中藥飲片有限公司，天麻素對照品購自中國食品藥品檢定研究院，批號：110807- 201708；無水甲醇（南京化學試劑股份有限公司，色譜級）；其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 天麻素含量測定方法[13-15]

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX-SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（10 ∶90）；柱溫：25 ℃；檢測波長：220 nm；流速：1.0 ml/min；進樣量：10 μl；按天麻素峰計算理論板數不低于2000。

2.1.2 對照品溶液配制 精密稱取天麻素對照品（80 ℃真空干燥至恒重）5.25 mg，加無水甲醇溶解定容至5 ml，制成天麻素含量為1.05 mg/ml 的對照品儲備液。精密吸取該儲備液0.5 ml，加甲醇-水（10 ∶90）稀釋定容至10 ml，制得天麻素含量為52.5 μg/ml 的對照品溶液，備用。

2.1.3 供試品溶液配制 精密稱取提取物0.1 g，置于100 ml 錐形瓶中，精密量取加入50 ml 甲醇，稱重并超聲提取60 min，冷卻至室溫，稱定重量，減失的重量用甲醇補足，搖勻后濾過，棄去初濾液，精密量取15 ml 續濾液，水浴蒸干，用甲醇-水（10 ∶90）溶解并定容至10 ml，搖勻后濾過，棄去初濾液，取續濾液經0.45 μm 微孔濾膜過濾，備用。

2.1.4 陰性樣品試驗 按處方取天麻以外的其他藥材，依照該制劑的提取工藝提取，按2.1.3 項下方法配制陰性對照樣品溶液，并按2.1.1 項下色譜條件進行測定，液相色譜圖顯示，陰性樣品不干擾天麻素的測定。

2.1.5 線性關系 分別精密吸取2、4、6、8、10、12 μl 天麻素對照品溶液，按2.1.1 項下色譜條件測定，繪制標準曲線（圖1），橫坐標為天麻素進樣量（μg），縱坐標為吸收峰面積，得回歸方程Y=156 120X+5524.5，r=0.9998（n=6），表明天麻素進樣量在0.105～0.630 μg 范圍內具有良好的線性關系。

圖1 標準曲線圖

2.1.6 精密度試驗 精密吸取10 μl 天麻素對照品溶液，連續進樣6 次，色譜峰面積分別是1586662、1581203、1582306、1587701、1584065、1581509，RSD 為0.18%，表明該法精密度良好。

2.1.7 重現性試驗 取本品提取物6 份，每份約0.1 g，精密稱定，按2.1.3 項下方法配制樣品供試液，按2.1.1 項下色譜條件測定，色譜峰面積分別是1004661、1002935、998608、999659、999533、1006339，RSD 為0.32%，表明該法重現性良好。

2.1.8 穩定性試驗 精密稱取本品提取物0.1038 g，按2.1.3 項下方法配制樣品供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進行測定，每隔2 h 進樣一次，共8 次，色譜峰面積依次為999239、998745、1002368、998785、1001792、1000475、995426、996813，RSD 為0.24%，表明樣品溶液在14 h 內穩定。

2.1.9 加樣回收試驗 取本品提取物5 份，每份約0.1 g，精密稱定，置100 ml 錐形瓶中，分別精密加入天麻素對照品，按2.1.3 項下方法配制供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件測定，計算回收率，結果（表1）表明該法的加樣回收率良好。

表1 天麻素加樣回收率測定結果（n=5）

2.1.10 樣品測定 取本品提取物約0.3 g，精密稱定，按2.1.3 項下方法配制供試品溶液，分別精密吸取天麻素對照品溶液和供試品溶液各10 μl，按2.1.1 項下色譜條件測定，液相色譜圖（圖2），按外標法計算天麻素含量。

圖2 高效液相色譜圖

2.2 單因素試驗結果

采用單因素法考察提取溶媒、溫度、時間及藥材粉碎度和浸泡時間等因素對提取效率的影響。分別用水和一定濃度乙醇（40%、50%、60%、70%）進行提取，結果表明以60%～70%乙醇提取，天麻素含量較高；用60%乙醇采用室溫浸漬、熱浸漬、回流等方法進行提取，結果顯示回流提取天麻素提取率最高；提取時間越長出膏率越高，但天麻素含量卻會降低，說明天麻素對熱不穩定，同時提取時間延長會使無效成分增多，影響提取物質量，故選擇提取時間在1～2 h；藥材粉碎度會影響提取效果，粉碎得越細，藥材與溶媒接觸面積越大，提取率越高，但粉末細度小的提取液不易濾過，因此藥材粉碎不宜太細，選擇通過20 目篩的藥粉為宜；藥材回流前浸泡有助于有效成分的浸出和提取，分別考察了浸泡30、60、90、120 min 對提取效果的影響，結果表明浸泡60 min 提取物中天麻素含量較高，但再延長浸泡時間，提取效果無明顯改變，故選擇浸泡時間為60 min。

2.3 正交試驗結果

正交試驗在預試驗的基礎上，選擇的影響因素包括乙醇濃度（A）、提取次數（B）、提取時間（C）、溶媒用量（D），根據所制定的因素水平（表2），每個因素包括三個水平，按L9（34）正交表安排試驗。

稱取處方中藥材60 g，粉碎過20 目篩，按表2實驗條件加提取溶媒浸泡60 min，進行提取，提取液過濾，濾液加提取溶媒定容于1000 ml 容量瓶，精密量取30 ml，用于測定出膏率；剩余的濾液真空濃縮至稠膏，真空干燥得樣品干膏粉，按2.1.10 測定方法測定天麻素含量（以每克藥材中提取的天麻素量計），見表3。

表2 正交試驗因素水平表

極差分析（表3）中R1表示以出膏率為指標的極差，R2表示以天麻素含量為指標的極差，R3表示以綜合評價為指標的極差。結果顯示，以出膏率為指標，提取次數影響最大；以天麻素含量為指標，乙醇濃度影響較大，但與其他因素的影響無顯著性差異；用綜合加權評分法將兩種指標轉化為分值，綜合評分值=（N/Nmax）×60+（W/Wmax）×40，其中“N”表示天麻素含量測定值，“Nmax”表示天麻素含量最大值，“W”表示提取物出膏率測定值，“Wmax”表示出膏率最大值，對綜合評分值進行極差和方差分析（表4），結果顯示，提取次數影響最顯著（P＜0.05），其次為提取時間和乙醇濃度（0.05 ＜P＜0.1），溶媒用量影響最小，最優方案應為A1B3C3D3，即應選擇60%乙醇，提取3 次，每次2 h，每次用10 倍的提取溶媒；但由于提取時間和溶媒用量均未顯示顯著差異性，為降低原料和能源成本，故將提取時間和溶媒用量進行調整，第1 次提取時間1.5 h，溶媒用量為10 倍；第2、3 次提取時間為1 h，溶媒用量為8 倍。

表3 正交試驗結果

表4 方差分析表

2.4 最佳提取工藝的驗證

稱取處方中各藥材，粉碎過20 目篩，每次提取前浸泡60 min，按選定的最佳提取工藝條件進行驗證，見表5，平均出膏率為19.25%（n=3），天麻素含量平均值為0.9036 mg/g（n=3），證明所選提取工藝條件穩定可行。

表5 驗證試驗結果（n=3）

3 討論

中藥復方制劑是以中醫藥理論為依據，其所含的多種生物活性成分，對機體發揮綜合的調節作用，提取工藝研究是制劑成型的關鍵，提取工藝選擇應有效提取主要生物活性成分，同時兼顧其他中藥的活性成分。預實驗對水和不同濃度的乙醇提取工藝進行了比較，結果表明用60%～70%乙醇提取，天麻素提取率較高，且天麻素和鉤藤堿對熱均不穩定，用適宜濃度乙醇提取可保證各種活性成分的穩定性；在正交試驗中，以天麻素含量和出膏率為測定指標，且對兩種測定指標引入加權系數進行綜合評價，考察了各因素對提取效果的影響，并在考慮降低原料和能源成本的基礎上優選最佳提取工藝，即用60%乙醇回流提取3 次，第1 次用10 倍量溶媒，提取1.5 h，第2、3 次分別用8 倍量溶媒，提取1 h，經驗證該工藝穩定可行。在用60%乙醇提取過程中由于乙醇易揮發，回流時溫度過高、蒸汽量過大、冷凝水流量過小均會導致乙醇揮發，因此需嚴格控制回流溫度，減少加熱蒸汽流量，使容器中提取液保持微沸狀態，加大冷凝水流量使乙醇在冷凝管中充分冷凝；回流結束后提取液需置于密閉性容器中自然降溫，減少乙醇揮發所造成的損失。

天麻素含量測定考察了不同比例甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液等流動相對分離效果的影響，選用甲醇-0.1%磷酸溶液（10 ∶90）為流動相，分離效果較好，方法簡便易操作、準確且重復性及穩定性良好，可為該制劑研制過程中成品及中間體提供有效的質量控制方法。