高靈敏熒光定量檢測HCV-RNA在丙肝診療中的應用研究

吳嘉銳 王軍 梁連輝 鄧紀望 李淑麗 何娟 蔡常輝

廣東省中山市第二人民醫院檢驗中心，廣東中山 528447

丙型病毒性肝炎（hepatitis C virus，HCV 簡稱“丙肝”）是較常見的一種肝臟疾病傳染性疾病，呈全球流行，不同性別、年齡、種族人群均對HCV 易感，HCV 的感染具有隱匿性，丙型肝炎病毒也是導致肝硬化和肝細胞癌的主要危險因素[1-2]。HCV 無或僅有輕微的臨床癥狀和體征，缺乏特異性，臨床診斷十分困難，必須依賴實驗室診斷。而實驗室診斷中病原學的診斷是確定診斷的唯一依據。HCV基因組為單股正鏈 RNA，易變異，HCV 感染的實驗室診斷包括抗原、抗體檢測和HCV-RNA 定量檢測，其中抗原的檢測主要用于免疫缺陷等特殊患者的篩查，抗-HCV 檢測主要用于一般HCV 感染者的初篩，血清 HCV-RNA 定量檢測是實驗室診斷丙型肝炎的金標準，且不同廠家試劑提取核酸方法不同，靈敏度和和特異性不同，直接影響臨床診療方案的制定[3-5]。中國HCV 防治現狀可以概括為“三高三低”，就是說“高隱匿、高漏診、高慢性化，認知率低、就診率低、治療率低”。早診斷、早發現、早治療是防控HCV 傳染源和阻斷傳播途徑最為有效的手段[6-7]。新出現的“磁珠法”提取核酸，提取效率高，操作步驟簡單，重復性好，可溯源，可實現自動化，是未來核酸分離純化方法發展的一個重要方向。本研究通過高靈敏熒光定量檢測丙型病毒性肝炎病毒核酸（HCV-RNA）在丙型病毒性肝炎診療中效果，取得滿意的臨床療效，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年2月至2019年2月中山市第二人民醫院（我院）肝病門診及戒毒所體檢可疑感染丙肝的患者臨床血清樣本126例，其中年齡19～62 歲，平均（33.84±6.59）歲，納入標準：①均符合《丙型肝炎防治指南》的慢性丙型肝炎診斷標準[8]；②依從性良好，自愿配合本研究者；③所有丙型病毒性肝炎患者均經本院醫學倫理委員會研究決定，知情并自愿簽署同意書。排除標準：①合并乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒等嗜肝病毒感染的患者；②具有發生肝硬化或者原發性肝癌的患者；③具有肝硬化、原發性肝癌及自身免疫性肝病的患者；④合并其他免疫系統疾病、精神疾病及孕婦或妊娠期婦女；⑤依從性差不能配合本研究的患者。將所有體檢可疑感染HCV 的患者臨床血清樣本126例，分別采用HCV 磁珠法試劑和對照試劑檢測血清中RNA 水平。

1.2 方法

1.2.1 血液標本收集 收集肝病門診及戒毒所體檢可疑感染丙肝的血液標本，所有患者于入組后清晨空腹抽取外周靜脈血3 ml 及5 ml，每位患者共2 支標本，一支為EDTA(紫色管)3 ml，一支為紅色無抗凝管5 ml；3000 r/min 離心10 min 取上清，-20℃儲存。

1.2.2 研究方法 ①分別用磁珠法提取核酸熒光定量PCR 試劑及柱提取核酸熒光定量PCR 試劑測定病毒核酸HCV-RNA 載量；②用酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測丙肝核心抗原、抗體。

1.3 觀察指標

觀察分析采用磁珠法試劑和對照試劑檢測血清中RNA 水平。

1.4 統計學處理

本研究數據采用SPSS 23.0 統計學軟件計算分析，計量資料以()表示，采取Kappa檢驗分析，血清中RNA 水平比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 磁珠法試劑和對照試劑檢測血清中RNA水平的比較

磁珠法試劑檢測126例樣本中有54例陽性，72例陰性；對照試劑檢測126例臨床樣本中有44例陽性，82例陰性，磁珠法試劑和對照試劑檢測血清中RNA 水平陽性率比較，差異無統計學意義（χ2=1.670，P=0.196），見表1.

表1 HCV磁珠法試劑和對照試劑定量檢測血清中RNA水平的比較[n(%)]

2.2 磁珠法試劑和對照試劑HCV熒光定量檢測結果比較

126例臨床樣本的 HCV 熒光定量檢測試劑的檢測結果，見表 2。

表2 磁珠法試劑和對照試劑HCV熒光定量檢測結果

2.3 磁珠法試劑和對照試劑高靈敏熒光定量檢測結果一致性分析

磁珠法試劑和對照試劑檢測結果陽性一致性為100.00%，陰性一致性為87.80%（72/82），總一致性為92.06% [（44+72）/126]。對磁珠法試劑和對照試劑檢測結果的一致性采取Kappa分析，磁珠法試劑和對照試劑檢測結果的存在顯著一致性(Kappa=0.162，P=0.0000)，見表3。

表3 磁珠法試劑和對照試劑高靈敏熒光定量檢測結果一致性分析

2.4 磁珠法試劑和對照試劑相關性分析

對磁珠法試劑和對照試劑檢測結果都為陽性的 44例樣本，分別取對數值。分析結果顯示，磁珠法試劑與對照試劑的定量檢測結果具有線性相關（r=0.947，P=0.003），磁珠法試劑與對照試劑的回歸方程y=0.634x+0.9000。

3 討論

目前全世界約有1.85 億人感染丙型肝炎病毒，HCV 是由丙型肝炎病毒引起的，感染率逐年增高，呈全球性流行，常規傳播途徑主要是母嬰傳播、醫療機械傳播、經破損的皮膚和黏膜傳播，全世界不同性別、年齡、種族人群均對 HCV 易感，且每年新增感染者約35 萬，以肝臟病變為主的傳染性疾病，表現為急性和慢性病毒性肝炎（50%～85% 的丙型肝炎），其中慢性丙肝可發展成纖維化、肝硬化（10%～15% 的患者）甚至肝細胞癌，這就勢必增加了肝癌的發生率，死亡人數也成倍增長[9-10]。丙肝起病隱匿，大部分患者癥狀不明顯，最新文獻顯示，75%～90%HCV 感染者未意識到自身的感染情況，80%HCV 感染者發展為慢性肝炎。丙肝已經被公認為是造成全球慢性肝臟疾病的主要原因，約有27%肝硬化、25%肝癌是由丙肝引起的[11-12]。對丙肝進行早期準確診斷、進行科學合理治療和療效監測具有重要的臨床價值。常規的診斷方法包括HCV-RNA、HCV 重組免疫法，丙肝已經成為不可忽視的公共衛生問題，應當進一步深入研究。

HCV 感染的實驗室診斷包括抗原、抗體、和HCV-RNA 定量檢測，其中抗-HCV 檢測主要用于HCV 感染者的的初篩，抗原的檢測主要用于免疫缺陷等特殊患者的篩查，高敏感度 HCV-RNA 定量檢測已經成為丙肝治療監測的趨勢，而HCV-RNA 定量檢測是唯一確定HCV 現癥感染的實驗室指標，作為典型的,HCV-RNA 病毒分裂，通常在檢定過程中，被視作金標準[13]。對于抗原或抗-HCV 陽性者，應進一步進行HCV-RNA 定量檢測，以確定是否為丙型肝炎患者。根據丙型肝炎防治指南（2015年更新版）意見，HCV-RNA 定量檢測是診療丙肝的“金標準”，抗病毒治療前病毒基線載量分析，抗病毒治療過程中及治療結束后的應答評估，均需要高靈敏準確丙肝核酸檢測。由此可見，選擇一種高靈敏的丙肝核酸檢測方法至關重要。

目前國內外丙肝核酸的檢測方法有多種，質量也參差不齊，實驗靈敏度相差甚遠。在各種方法中，血清或血漿樣本中病毒核酸的提取手段，是影響HCV-RNA 定量結果最為關鍵的因素之一。新出現的“磁珠法”提取核酸，提取效率高，操作步驟簡單，重復性好，可溯源，可實現自動化，是未來核酸分離純化方法發展的一個重要方向。磁珠法核酸提取是以磁珠為載體，通過運用磁珠在高鹽低pH 值下吸附核酸，在低鹽高pH 值下與核酸分離的物理方法的原理過程，并采取移動磁珠或轉移液體來實現核酸的整個提取純化過程[14-15]。磁珠法（MBM）提取核酸建立了一種快速、簡便的血清或血漿病毒核酸提取方法。我院檢驗中心使用MBM 來純化核酸的最大優點就是自動化，省時省力，有效的降低了人工成本，提取方法簡便、快捷。磁珠在磁場條件下能夠顯著地進行聚集或分散,徹底擺脫離心等所需的手工操作流程，可以盡快的得到試驗數據，有效地減少了試驗成本，大大地降低了患者的經濟負擔且，且早日為患者的確診及治療爭取了時間。

本研究結果顯示，磁珠法試劑檢測126例樣本中有54例陽性，72例陰性；對照試劑檢測126例臨床樣本中有44例陽性，82例陰性，磁珠法試劑和對照試劑的陽性樣本具較好的一致性（P=0.000），磁珠法試劑與對照試劑的定量檢測結果具有線性相關（r=0.947，P＜0.05）。本研究中采用磁珠法提取核酸高靈敏熒光定量檢測HCV-RNA 在中山市乃首創，如能在中山市醫療系統重點單位順利推廣或為本區域患者集中檢測，將為廣大丙肝患者的抗病毒治療帶來新的認識，進一步取得新的療效。