基于二代測序技術(shù)的etDNA與ctDNA在肺癌合并胸腔積液診斷中的臨床價值研究

熊柳冰

廣東省惠東縣人民醫(yī)院腫瘤科，廣東惠東 516300

隨著分子診斷技術(shù)以及精準醫(yī)療的發(fā)展，靶向治療成為中晚期非小細胞肺癌主要治療手段[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2-3]，無非小細胞肺癌驅(qū)動基因表皮生長因子受體（EGFR）敏感突變證據(jù)的患者即使應(yīng)用靶向藥物治療，其療效也相當(dāng)于安慰劑，可見靶向治療成功的關(guān)鍵在于精準檢測EGFR 基因突變。以往在臨床中EGFR 基因突變樣本主要是從腫瘤組織中選取，操作較為繁瑣，且對患者機體創(chuàng)傷也大，推廣受限[4]。近年有學(xué)者提出，外周血、胸腔積液存有實性腫瘤組織成分，能夠用于EGFR 基因突變檢測[5]。本研究選取惠東縣人民醫(yī)院（我院）40例患者進行研究，比較胸腔積液DNA（etDNA）與外周血DNA（ctDNA）檢測在肺癌合并胸腔積液診治中的應(yīng)用價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年5—12月我院收治的40例晚期非小細胞肺癌合并胸腔積液患者為研究對象，其中有男22例，女18例；年齡41～77 歲，平均（65.09±9.74）歲；病理類型：8例肺鱗癌，32例肺腺癌。納入標準：①經(jīng)病理組織學(xué)活檢確診為原發(fā)性非小細胞肺癌；②肺部CT 及胸腔積液細胞學(xué)檢查證實有惡性胸腔積液；③臨床TNM 分期屬于Ⅳ期；④自愿接受基因突變檢測，簽訂了同意書。排除標準：①納入研究前已接受放療、化療、靶向治療；②伴有其他惡性腫瘤病史。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批同意。

1.2 檢測方法

1.2.1 收集樣本 ①血樣本：收集患者清晨空腹肘靜脈血3～5 ml，并以2000 r/min 速率進行離心處理10 min，將血細胞與血漿分離，取上層血漿待檢；②胸水樣本：采集50～100 ml 新鮮胸腔積液作為樣本，以2000 r/min 速率進行離心處理10 min，棄掉上清液，取沉淀物質(zhì)待檢；③腫瘤組織樣本：在胸腔鏡下鉗取適量腫瘤組織樣本。

1.2.2 樣本DNA 提取 ①提取血樣本DNA：應(yīng)用QIAamp DNA Blood Mini Kit 試劑盒（上海聯(lián)碩生物科技有限公司）提取血漿中的游離DNA，嚴格按照試劑盒操作；②提取胸腔積液、腫瘤組織DNA：均應(yīng)用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 試劑盒（北京諾博萊德科技有限公司）提取胸腔積液細胞、腫瘤組織DNA，嚴格按照試劑盒操作。同時，將提取后的ctDNA、etDNA、tDNA 應(yīng)用Qubit 分析試劑盒[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]分別進行定量分析。

1.2.3 高通量二代測序檢測 采用基于雜交捕獲法的二代測序技術(shù)檢測各樣本基因變異序列數(shù)目與參考序列數(shù)目的比值（AF 值）以及EGFR 基因變異情況，包括點突變、擴增、插入/缺失等，檢測平臺為NextSeq 500 高通量測序儀及其配套的試劑盒（美國Illumina 公司），嚴格按照儀器說明書操作。其中，ctDNA 的投入量30～80 ng，檢測質(zhì)控要求：中位測序深度保持在12000×以上，有效測序量≥2000×；etDNA、tDNA 的投入量30～80 ng，檢測質(zhì)控要求：中位測序深度保持在1000×以上，有效測序量200～500×。

1.3 觀察指標

①比較40例患者etDNA、ctDNA、tDNA 的AF值差異；②以tDNA 檢測出的EGFR 基因突變結(jié)果為金標準，分析ctDNA、etDNA 檢測EGFR 基因突變的診斷效能。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計數(shù)資料以率描述，經(jīng)χ2檢驗；計量資料以（）描述，兩組間比較經(jīng)t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 etDNA、ctDNA、tDNA檢測結(jié)果比較

40例患者的etDNA 的AF 值較ctDNA 明顯升高（P＜0.05），而與tDNA 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 etDNA、ctDNA、tDNA檢測結(jié)果比較

2.2 etDNA、ctDNA、tDNA檢測EGFR基因突變的臨床效能分析

以tDNA 檢測出的EGFR 基因突變結(jié)果為金標準，etDNA 檢出EGFR 基因突變的敏感度及準確性明顯高于ctDNA 檢測（P＜0.05），見表2～3。

表2 etDNA、ctDNA、tDNA檢測EGFR基因突變結(jié)果

表3 etDNA與ctDNA檢測EGFR基因突變的臨床效能[%（n/n）]

3 討論

EGFR 為受體氨酸激酶的一種，主要來源于上皮細胞、間葉細胞中。目前已有大量研究證實[6-7]，EGFR 在惡性腫瘤組織中過度表達，是癌細胞增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移的主要調(diào)節(jié)因素。另有研究報道[8]，EGFR 在正常肺組織中不表達或低表達，而在非小細胞肺癌組織中由于基因擴增、過表達等，EGFR 呈高表達。在癌細胞活躍狀態(tài)下，EGFR 通路異常也被激活，EGFR 活性明顯增加，難以抑制腫瘤細胞生長，進一步促進癌灶增殖分化、轉(zhuǎn)移等，故EGFR 為非小細胞肺癌治療的主要靶分子[9]。研究也發(fā)現(xiàn)[10]，準確檢測EGFR 基因突變情況嚴格篩選適合靶向治療的非小細胞肺癌患者，對于提高療效具有積極的作用。

在臨床上，與靶向治療有關(guān)的DNA 基因突變檢測的方法有RT-PCR 定量檢測、Sanger 測序等，本研究指出上述方法具有通量較低、檢測費用高等不足[11]。研究發(fā)現(xiàn)[12]，二代測序技術(shù)能夠有效解決腫瘤細胞異質(zhì)性的問題，其檢測靈敏度較一代測序技術(shù)顯著升高，可檢測到低至0.1%的低頻突變，并可以同時檢測多個樣本多種基因突變情況，達到深度測序的目的。

在EGFR 基因突變檢測的樣本來源方面，腫瘤病灶組織為“金標準”，但腫瘤組織取材困難，不利于動態(tài)監(jiān)測靶向治療后EGFR 基因變異情況，易對患者機體造成創(chuàng)傷[13]。液體活檢為一種新興的基因檢測方式，因具有無創(chuàng)、操作簡單、便于動態(tài)監(jiān)測等優(yōu)點而逐漸應(yīng)用于臨床中。血漿、胸腔積液等均屬于液體活檢范疇。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，40例患者etDNA 的AF 值較ctDNA 明顯升高，且以tDNA 檢測出的EGFR 基因突變結(jié)果為金標準，發(fā)現(xiàn)etDNA檢出EGFR 基因突變的敏感度及準確性明顯高于ctDNA 檢測，提示與胸腔積液DNA 檢測EGFR 基因突變的診斷效能優(yōu)于外周血DNA。筆者分析其原因主要是，血漿樣本中的腫瘤細胞DNA 片段濃度相對較低，而惡性胸腔積液中含有多腫瘤細胞，其存有的腫瘤細胞DNA 片段濃度相對更高，故選用胸腔積液DNA 檢測EGFR 基因突變的敏感度更高[14]。但本研究中，胸水樣本與腫瘤組織樣本的基因突變檢測結(jié)果仍有一定的差異，這可能是采集的樣本中存有的突變DNA 含量低于監(jiān)測范圍，故其檢測假陰性，此外也有可能是腫瘤組織異質(zhì)性所導(dǎo)致的[15]。

綜上，與ctDNA 檢測相比，應(yīng)用二代測序技術(shù)檢測etDNA 診斷晚期非小細胞肺癌合并胸腔積液的敏感度更高，對于臨床早期診治具有良好的指導(dǎo)性意義，故在實際臨床中當(dāng)腫瘤組織樣本獲取較為困難時，可選擇胸腔積液代替進而EGFR 基因突變檢測。