環狀RNA在子宮內膜異位癥中的表達及意義〔1〕

陳美紅，張曉玲

(江西省婦幼保健院，江西 南昌 330006)

子宮內膜異位癥(EMs)是婦科常見病，常出現慢性盆腔痛、痛經、不孕、異常陰道流血等臨床癥狀，嚴重影響廣大婦女的生活質量[1]。隨著高通量測序技術的發展，許多新的生物信息學方法應用于臨床疾病的生物學診斷。最近研究發現環狀RNA(circRNA)在許多疾病中發揮重要作用，故本文通過高通量測序技術研究circRNA在EMs中的表達情況及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月—2018年12月我院婦科住院的子宮內膜異位癥患者4 例為觀察組，年齡20～45 歲；同期在我院婦科門診行常規婦科檢查患者4 例為對照組，年齡20～45 歲。兩組患者月經周期規律；術前6 個月無甾體類激素治療史。納入標準：經腹腔鏡手術及術后病理檢查診斷為子宮內膜異位癥；患者均知情同意并經醫院倫理委員會批準。排除標準：婦科惡性腫瘤及其他部位惡性腫瘤、心腦血管等重要器官疾病；妊娠期或哺乳期。

1.2 方法

用抗凝管采集患者靜脈外周血5～10 mL，混勻，離心10 min，分離出血漿成分，分裝至凍存管，放置-80 ℃冰箱保存備用。提取血漿中的RNA，并測定其濃度及純度。用總RNA文庫預試劑盒(Illumina)實現了構建測序文庫的RNA預處理，使用Agilent 2100生物分析儀進行質量控制和量化，然后在Illumina Hi-Seq2500測序系統進行測序，通過分析，得到高質量的circRNA表達量。

1.3 統計學方法

用R語言軟件包(version 3.6)對circRNA的表達量進行標準化及處理，找出兩組之間circRNA表達的差異，用熱圖表示出結果，fold change≥2和P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

通過高通量測序技術，共得到363 個circRNA在觀察組及對照組之間差異有統計學意義，其中有192 個高表達的circRNA和171 個低表達的circRNA。用熱圖表示差異性circRNA的相對表達量(見圖1)。通過比較，找到6個表達顯著的差異性circRNA的相對表達量，其中低表達的circRNA有：has-circRNA-001808，has-circRNA-402533，has-circRNA-405971。高表達的circRNA：has-circRNA-000881，has-circRNA-406655，has-circRNA-023016(見圖2)。

深色代表circRNA相對高表達，淺色代表circRNA相對低表達量圖1 兩組circRNA表達熱圖

圓點表示在觀察組的表達量；正方形表示在對照組的表達量，***代表P<0.001，**代表P<0.01，*代表P<0.05。control為對照組；treat為觀察組圖2 6個差異性circRNA在兩組的相對表達量

3 討 論

EMs是指子宮內膜組織(腺體和間質)異位在子宮體以外的部位，主要包括盆腔臟器和壁腹膜，如卵巢、子宮骶韌帶、腸管等部位。EMs雖是良性疾病，但具有發病率高、復發率高、治療效果欠佳等特性，全球約1.76 億婦女遭遇該疾病的折磨[2]。迄今為止，EMs的病因學及發病機制尚不明確，包括經血逆流學說、遺傳因素[3]、免疫因素[4]、炎癥[5]、類腫瘤疾病[6]等。研究表明[7]，EMs具有惡性腫瘤相似的生物學行為，如細胞侵襲、遷移、局部擴散、遠處轉移等。circRNA是1976年發現的一類特殊的非編碼RNA，與傳統的線性RNA不同，circRNA的3＇和5＇端共價結合，形成共價閉合連續環，具有組織特異性及高度保守性[8]。由于其特殊的生物結構，核酸外切酶無法將其降解，故circRNA比多數線性RNA具有更加穩定性的生物學功能。circRNA序列高度保守，具有組織特異性和發育階段特異性。它能作為miRNA“海綿”功能，充當miRNA的受體，抑制miRNA活性及致miRNA靶基因水平升高，參與腫瘤細胞的調控、增殖及侵襲[9]，如肺癌[10]、胃癌[11]、胰腺癌[12]等惡性腫瘤組織中發現差異性circRNA的表達情況。有學者[13-14]采取EMs患者在位內膜及異位內膜組織樣本進行circRNA微陣列分析及qRT-PCR驗證，發現5 個circRNA (circ-0004712，circ-0002198，circ-0003570，circ-0008951和circ-0017248)和8個mRNA(SCN3B，ENTPD1，IL16，BACH2，C3，CKS2，G0S2，PGRMC1) qRT-PCR的結果與微陣列結果相符，并構建了circRNA-miRNA-mRNA網絡，揭示癌癥相關的主要作用嘌呤代謝、甘油磷脂代謝、甲狀腺激素信號通路在EMs發病中的作用。Zhang等[15]通過微陣列檢測正常內膜、EMs在位內膜及異位內膜的circRNA表達情況，發現2 237個差異性circRNA，8 個circRNA可能是參與上皮-間質轉化過程。另外Wang等[16]也通過對EMs在位內膜組織及異位內膜組織相比較，發現146個上調circRNA及148個下調circRNA，可能參與EMs的發生發展。以上研究報道均通過對患者的組織標本進行測序，而均未對外周血的circRNA進行高通量測序。本文通過對EMs患者靜脈外周血進行高通量測序，發現有363 個差異性表達的circRNA，其中有192 個高表達的circRNA和171 個低表達的circRNA，并找到6個表達顯著的circRNA的表達量，其中has-circRNA-001808，has-circRNA-402533及has-circRNA-405971呈現低表達；has-circRNA-000881，has-circRNA-406655及has-circRNA_023016呈現高表達。通過研究比較發現血液中的circRNA與組織的circRNA的表達量有些相同，具體原因有待于進一步研究。

目前有不少對于circRNA作為RNA家族成員的研究，雖然命名了很多種circRNA，但只有少數circRNA的生物學功能及機制得到確定，大部分仍然處在研究初期。與其他類型的內源性RNA相比，circRNA具有高度保守、結構穩定、表達量高、穩定性強、與miRNA結合位點多等優點。隨著高通量測序技術的進步，circRNA的檢測越來越方便。circRNA可以分泌到細胞外環境，在組織、血液、體液中能檢測出circRNA。關于circRNA在EMs的病因學及發病機制研究才剛起步，僅發現幾種與EMs相關的circRNA，circRNA可能作為EMs的診斷標志物，我們下一步將通過qRT-PCR驗證circRNA高通量測序結果，并進行生物學功能及信號通路分析，為EMs的發病機制提供一定的幫助。