五味子丙素對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞衰老作用的影響及機制

蘇小明，王岳楊，徐銘晨，陳悅琪，李賀，王春梅，陳建光，李正祎，莊文越*

1北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林省吉林市 132013；2北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林省吉林市 132013；3吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗學(xué)院，吉林省吉林市 132013

皮膚衰老是人體衰老的一部分，由內(nèi)源性和外源性的多種因素引起，主要包括基因?qū)ζつw衰老過程的調(diào)控、自由基損傷和光刺激老化作用等。近年來，衰老與抗衰老已成為科學(xué)研究的熱點[1-3]。五味子丙素(Schisandrin C，SchC)是五味子的主要木脂素類成分之一，可抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)、抗氧化及抑制凋亡蛋白的表達[4]。侯微等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞自由基氧化損傷衰老模型中，SchC可提高細(xì)胞存活率，但其對細(xì)胞的抗衰老和抗凋亡作用及其機制尚不清楚。為此，本研究分析了SchC對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用及其可能機制，以期為SchC相關(guān)抗皮膚衰老產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 SchC(四川省維克奇生物科技有限公司)；HaCaT細(xì)胞(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)；CCK-8(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、微量丙二醛(MDA)、微量還原型谷胱甘肽(GSH)、活性氧(ROS)試劑盒及BCA蛋白試劑盒(南京建成生物工程研究所)；NF-E2相關(guān)因子2(Nrf-2)、血紅素加氧酶-1(HO-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-9、caspase-3、caspase-9、Bcl-2、核因子-κB(NF-κB)、p-NF-κB(ABclonal公司)；RNA抽提試劑盒、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR、2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(美國Vazyme公司)。全自動凝膠成像系統(tǒng)、ImageJ分析軟件(上海天能科技有限公司)；Nrf-2抑制劑ML385(美國Abmole公司)；NF-κB抑制劑SN50(美國Selleck公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞生長至80%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化，分瓶傳代。

1.3 CCK-8法檢測HaCaT細(xì)胞增殖活性 將HaCaT細(xì)胞加入96孔板中(105個/孔，每孔200 μl)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁。設(shè)置對照組與實驗組，每組分別設(shè)置6個平行組，按照SchC(2.5、5、10、20、40、80、100、200、320 μmol/L，作用24 h)和H2O2(200、400、600、800、1000 μmol/L，作用4 h)濃度梯度上樣。每孔加入20 μl CCK-8孵育2 h，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的光密度(OD)值。對比對照組，篩選細(xì)胞存活率為60%時的H2O2濃度，即H2O2最終使用濃度[6-7]；篩選對細(xì)胞增殖無明顯影響的SchC濃度，即SchC最終濃度。細(xì)胞存活率(%)=(OD處理/OD對照) ×100%。

1.4 實驗分組及細(xì)胞氧化應(yīng)激模型建立 將HaCaT細(xì)胞接種于6孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使其貼壁，設(shè)置對照組、H2O2模型組與SchC處理組。對照組、H2O2模型組用含1%血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，對照組給予2.5 ml 1% DMEM培養(yǎng)基，H2O2模型組加入2.5 ml確定濃度的H2O2(1% DMEM)作用4 h；SchC處理組用SchC預(yù)處理24 h后，加入2.5 ml確定濃度的H2O2(1% DMEM)作用4 h。Nrf-2抑制劑組和NF-κB抑制劑組分別加入0.25 μmol/L ML385和20 μmol/L SN50預(yù)處理2 h。

1.5 細(xì)胞中SOD、MDA、ROS及GSH水平檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板中，設(shè)置對照組、H2O2模型組與SchC處理組，每組設(shè)3個復(fù)孔，按1.4方法處理后，收集細(xì)胞，按照SOD、MDA、ROS和GSH試劑盒說明書步驟檢測細(xì)胞SOD、MDA、ROS和GSH水平。

1.6 qRT-PCR檢測環(huán)氧合酶-2(COX-2)、MMP-1、MMP-9、caspase-3、caspase-9、Bcl-2 mRNA的表達 按1.4方法處理后，應(yīng)用RNA抽提試劑盒提取細(xì)胞總RNA，按HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟合成cDNA。按ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書步驟行實時熒光定量PCR擴增反應(yīng)，在NCBI(National Coalition Building Institute)中查找基因序列，用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計引物。擴增反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s (1個循環(huán))，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s (40個循環(huán))，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。繪制熔解曲線，采用2-ΔΔCt法進行相對定量。引物序列如表1 所示。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR

1.7 Western blotting檢測COX-2、基質(zhì)金屬蛋白酶、凋亡相關(guān)蛋白、衰老相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf-2)、血紅素加氧酶-1(HO-1)，以及NF-κB、p-NF-κB的表達 按照1.4方法處理后，收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，RIPA緩沖液冰上裂解1 h，4 ℃下12 000 r/min離心5 min，分離上清液。用BCA試劑盒測定總蛋白濃度，用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離凝膠分離45 μg蛋白并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)中。5%脫脂牛奶25 ℃下封閉1 h，加入COX-2(1:1000)、MMP-1 (1:1000)、MMP-9(1:1000)、caspase-3(1:1000)、aspase-9(1:1000)、Bcl-2(1:1000)、P16(1:1000)、P21(1:500)、Nrf-2(1:500)、HO-1(1:1000)、NF-κB (1:1000)、p-NF-κB(1:500)特異性抗體孵育過夜。用含吐溫-80(TBS-T)的Tris緩沖液洗滌，加入抗兔辣根過氧化物酶抗體(1:10 000)孵育1 h。用增強型ECL顯影液顯色，全自動凝膠成像系統(tǒng)采集和分析數(shù)據(jù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，行方差齊性檢驗，方差齊時多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；方差不齊時組間比較采用Welch法進行近似方差分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SchC和H2O2對HaCaT細(xì)胞活力的影響 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，SchC濃度≤100 μmol/L時對HaCaT的增殖沒有明顯影響(P＞0.05，圖1A)，不同濃度(200、400、600、800、1000 μmol/L)的H2O2對HaCaT細(xì)胞活力有一定的影響，且呈濃度依賴性(P＜0.05，圖1B)。當(dāng)H2O2濃度為800 μmol/L時，細(xì)胞存活率降至對照組的(57.0±3.0)%(P＜0.001)。因此，選擇800 μmol/L的H2O2作用4 h建立細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。

圖1 SchC(A)和H2O2(B)對HaCaT細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of SchC (A) and H2O2 (B) on the relative viability of HaCaT cells

2.2 SchC對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞生長形態(tài)和增殖活性的影響 倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化，結(jié)果如圖2A所示。對照組細(xì)胞生長至24 h時，形態(tài)規(guī)則，大小均勻，透亮度高，邊界清楚，細(xì)胞排列較緊密。與對照組相比，H2O2模型組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞皺縮，飄浮細(xì)胞增多，細(xì)胞不規(guī)則且連接不緊密，細(xì)胞數(shù)量減少，培養(yǎng)液中細(xì)胞碎片增多。與H2O2模型組相比，SchC預(yù)處理可一定程度恢復(fù)細(xì)胞的形態(tài)，漂浮細(xì)胞減少，培養(yǎng)液中細(xì)胞碎片減少，細(xì)胞存活率增高[(53.0±3.0)% vs. (70.0±3.0)%，P＜0.01，圖2B]。

2.3 SchC對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞SOD、MDA、GSH、ROS水平的影響 與對照組相比，H2O2模型組SOD、GSH水平明顯降低(P＜0.01)，MDA水平明顯升高(P＜0.001，圖3A)。與對照組相比，H2O2模型組熒光效果增強，ROS水平明顯增高(P＜0.001，圖3 B、C)。與H2O2模型組相比，Sc hC 處理組SOD、GSH水平明顯升高(P＜0.05)，MDA、ROS水平明顯降低(P＜0.05或P＜0.01，圖3)。

圖2 SchC對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞生長狀態(tài)和增殖活性的影響Fig.2 Effects of SchC on the growth status and cell viability of H2O2-induced HaCaT cells

圖3 SchC對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞SOD、MDA、GSH、ROS水平的影響Fig.3 Effects of SchC on the contents of SOD, MDA, GSH, and ROS of H2O2-induced HaCaT cells

2.4 SchC對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞COX-2、MMP-1、 MMP-9表達的影響 qRT-PCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，H2O2模型組COX-2、MMP-1、MMP-9 mRNA及蛋白表達水平均明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)；與H2O2模型組相比，SchC處理組COX-2、MMP-1、MMP-9 mRNA及蛋白表達水平均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01，圖4)。

2.5 SchC對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞caspase-3、caspase-9、Bcl-2表達的影響 如圖5所示，與對照組相比，H2O2模型組caspase-3、caspase-9 mRNA和蛋白表達水平均明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)，Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平均明顯降低(P＜0.01)。與H2O2模型組相比，SchC處理組caspase-3、caspase-9 m R N A 和 蛋 白 表 達 水 平 均 明 顯 降 低(P ＜0.0 5 或P＜0.01)，Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平均明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。

2.6 SchC對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白P16、P21表達的影響 如圖6所示，與對照組相比，H2O2模型組衰老相關(guān)蛋白P16、P21的表達上調(diào)(P＜0.01)；與H2O2模型組相比，SchC處理組衰老相關(guān)蛋白P16、P21的表達下調(diào)(P＜0.01)。

圖4 SchC對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞COX-2、MMP-1、MMP-9 mRNA和蛋白表達的影響Fig.4 Effects of SchC on the mRNA and protein expressions of COX-2, MMP-1 and MMP-9 of H2O2-induced HaCaT cells

圖5 SchC對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞caspase-3、caspase-9、Bcl-2表達的影響Fig.5 Effects of SchC on the mRNA and protein expressions of caspase 3, caspase 9 and Bcl-2 of H2O2-induced HaCaT cells

圖6 SchC對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白P16、P21表達的影響Fig.6 Effects of SchC on the expressions of aging-related proteins of P16 and P21 of H2O2-induced HaCaT cells

2.7 SchC對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞NF-κB、Nrf-2/ HO-1信號通路的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，H2O2模型組細(xì)胞Nrf-2、HO-1表達下調(diào)(P＜0.01、P＜0.05)，p-NF-κB表達上調(diào)(P＜0.05)；與H2O2模型組相比，SchC處理組Nrf-2及HO-1表達上調(diào)，p-NF-κB表達下調(diào)(P＜0.05， 圖7A)。加入Nrf-2抑制劑ML385(1.25 μmol/L)后，HO-1的表達被明顯抑制(P＜0.05)；加入SchC后，HO-1的表達上調(diào)(P＜0.01，圖7B)。加入NF-κB抑制劑SN50(20 μmol/L)后，COX-2、MMP-1、MMP-9的表達被明顯抑制(P＜0.05或P＜0.01)，促凋亡蛋白caspase-3、caspase-9的表達下調(diào)(P＜0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達上調(diào)(P＜0.01，圖7C、D)。

圖7 SchC對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞NF-κB、Nrf-2/HO-1信號通路的影響(Western blotting)Fig.7 Effects of SchC on the signaling pathway of NF-κB and Nrf-2/HO-1 of H2O2-induced HaCaT cells (Western blotting)

3 討 論

衰老是生命過程中的一種自然現(xiàn)象，涉及多種生物學(xué)過程。目前，有關(guān)衰老的學(xué)說主要有自由基學(xué)說、免疫學(xué)說、炎性學(xué)說等，其中以自由基學(xué)說最受重視[1]。皮膚易受外界環(huán)境中各種因素的刺激而導(dǎo)致氧化應(yīng)激。有研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激能夠誘發(fā)細(xì)胞衰老[8]。ROS是氧化應(yīng)激反應(yīng)中最重要的介質(zhì)，可引起機體蛋白質(zhì)、核酸變性以及脂質(zhì)過氧化，對皮膚細(xì)胞造成氧化損傷，從而導(dǎo)致或促進衰老的發(fā)生[9]。H2O2是一種常用的細(xì)胞氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑，可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS，從而導(dǎo)致皮膚發(fā)生一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)，如衰老、皺紋及色斑等[10]。近年來，中草藥被廣泛應(yīng)用于抗衰老的研究。與其他化學(xué)合成添加劑不同，中草藥具有成分天然、綠色、安全、不良反應(yīng)少等優(yōu)點，被國內(nèi)外學(xué)者大力推崇。五味子為木蘭科植物五味子的成熟干燥果實，主要活性成分為木脂素類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、保肝等多種藥理作用[11-12]。有研究發(fā)現(xiàn)，作為主要木脂素類成分之一，SchC具有抗炎和抗氧化的雙重作用，可通過調(diào)節(jié)NF-κB和Nrf-2/HO-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，抑制MAPK信號通路，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激活性[13]。五味子甲素、乙素及丙素對細(xì)胞均具有一定的保護作用，其中以SchC的效果最好，可以明顯提高細(xì)胞存活率，但其作用機制尚不明 確[5]。本研究通過分析NF-κB和Nrf-2/HO-1信號通路的變化，探討了SchC對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用及其可能分子機制。

H2O2可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生過多的ROS，當(dāng)ROS在細(xì)胞內(nèi)大量聚集超過機體的清除能力時，會導(dǎo)致氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平升高以及蛋白和核酸的氧化損傷，機體表現(xiàn)出衰老趨勢[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷模型中，SchC可提高細(xì)胞活力，與侯微等[5]的研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，SchC可以改善HaCaT細(xì)胞的生長狀態(tài)，對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷表現(xiàn)出保護作用。SOD與GSH是內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)中重要的抗氧化酶，可分解機體產(chǎn)生的自由基；MDA作為脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，可反映自由基攻擊細(xì)胞的損傷程度[15]。本研究中，SchC預(yù)處理HaCaT細(xì)胞，可以提高細(xì)胞中的SOD、GSH水平，降低MDA、ROS水平，從而減輕H2O2對細(xì)胞造成的氧化應(yīng)激損傷。MMPs的主要作用是水解細(xì)胞外基質(zhì)[16]，而細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分是膠原蛋白[17]。多項研究發(fā)現(xiàn)，過多的ROS可以促使MMPs(如MMP-1、MMP-9等)表達增加，使細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白降解，從而降低皮膚彈性，導(dǎo)致皺紋產(chǎn)生[16,18]。COX-2又稱環(huán)氧合酶-2(屬于誘導(dǎo)性酶)，是機體重要的炎性因子，可被過多的ROS誘導(dǎo)產(chǎn)生，與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)，過多的炎性因子可促使皮膚各種細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)相互作用，從而導(dǎo)致皮膚細(xì)胞和組織的損傷[21]。本研究中，SchC可以通過減少 MMP-1、MMP-9的表達而抑制膠原蛋白的降解，減少炎性因子COX-2的產(chǎn)生，從而抑制皺紋的產(chǎn)生，最終對H2O2造成的氧化應(yīng)激衰老模型起到保護作用。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自發(fā)的程序性死亡，是機體為適應(yīng)生存環(huán)境而主動采取的一種死亡過程[22]。ROS堆積于體內(nèi)可導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷及核酸變性，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)凋亡相關(guān)因子的表達[23]。研究發(fā)現(xiàn)，在眾多調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族中，caspase家族和Bcl-2家族起著重要作用[24]。本研究中，SchC可抑制凋亡相關(guān)基因的表達，表明SchC可通過抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡保護HaCaT細(xì)胞，從而發(fā)揮抗衰老作用。Nrf-2/HO-1信號通路是機體主要的抗氧化應(yīng)激通路之一，其主要功能是調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達、清除自由基，以減輕炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激對細(xì)胞造成的損傷[25-27]。當(dāng)機體受到ROS刺激后，Nrf-2激活并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與各種抗氧化元件結(jié)合，誘導(dǎo)下游靶基因HO-1及ROS清除酶(如SOD、MDA和GSH等)的表達，在抗ROS生成和氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用[28-32]。NF-κB是重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，參與多種細(xì)胞功能如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞黏附、增殖、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)等的調(diào)節(jié)[33-35]。 作為第二信使，ROS可通過激活NF-κB導(dǎo)致各種炎性因子如COX-2、MMP-1、MMP-2和MMP-9等的產(chǎn)生，從而造成氧化損傷和炎癥反應(yīng)[36-41]。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB是調(diào)節(jié)MMPs、COX-2、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的重要轉(zhuǎn)錄因子[42-43]。NF-κB通路與凋亡相關(guān)基因的表達密切相關(guān)，可通過調(diào)節(jié)Bcl-2和caspase途徑抑制炎癥和細(xì)胞凋亡[44]。本研究中，H2O2誘導(dǎo)的ROS在體內(nèi)過度累積，刺激NF-κB和Nrf-2信號通路及下游因子的表達，從而造成細(xì)胞氧化損傷和炎癥反應(yīng)，誘發(fā)細(xì)胞衰老。而SchC預(yù)處理可明顯抑制ROS的產(chǎn)生，降低衰老相關(guān)蛋白P16、P21的表達，激活Nrf-2信號通路，增加下游靶基因HO-1的表達并發(fā)揮抗氧化作用；還可抑制NF-κB信號通路，降低MMP-1、MMP-9、COX-2及凋亡相關(guān)基因mRNA和蛋白的表達，抑制膠原降解、凋亡和炎癥反應(yīng)，從而減輕H2O2對細(xì)胞造成的氧化應(yīng)激損傷，發(fā)揮抗老化作用(圖8)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，SchC可增加細(xì)胞的抗氧化能力，抑制衰老相關(guān)蛋白的表達，抑制膠原降解，減少細(xì)胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)，從而對H2O2造成的氧化應(yīng)激損傷衰老模型起到保護作用。這為五味子抗皮膚衰老產(chǎn)品的開發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

圖8 SchC保護H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞損傷的機制Fig.8 Proposed mechanism of SchC for the protection of H2O2-induced HaCaT cells