復發性阿弗他口腔炎組織中基因異常表達分析

穆艷超，陳新

(安陽市婦幼保健院 a.檢驗科;b.口腔科，河南 安陽 455000)

復發性阿弗他口腔炎(recurrent aphthous stomatitis，RAS)是常見的口腔黏膜疾病，具有周期復發的特點。RAS多發于舌、腭、唇、頰等處，主要表現為圓形、橢圓形、孤立的淺表性潰瘍，可出現顯著的灼燒感，飲食和說話可致疼痛加劇，不適感可影響患者飲食、言語，降低患者生活幸福感[1]。該病是國內外研究的熱點，但因其發病機制尚不明確，治療手段主要以抑制炎癥加重、緩解疼痛、促進潰爛愈合、延長疾病發作間歇期為目的，尚缺乏有效的治療手段[2]。研究顯示，有超過1/3的RAS患者具有顯著的遺傳易患性，人類白細胞抗原A2表型與RAS發生具有顯著相關性，血凝素基因缺陷患者的RAS發病率高達56%，葉酸代謝通路基因表達異常的人群RAS患病率顯著高于正常人群，細胞因子基因高表達的人群中RAS的發病率高于低表達人群[3-5]。本研究通過生物信息學分析篩選候選基因，并驗證JAK2、STAT3、IL-6、SOCS3、CXCR4在RAS組織中異常表達情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年9月至2020年10月安陽市婦幼保健院口腔科收治的25例RAS患者，取其病灶組織作為觀察組。納入標準：(1)病史1 a以上，1 a發作2次以上；(2)無其他口腔疾病，就診前3 d內未服用抗生素、止痛藥、免疫抑制劑等藥物；(3)年齡15～35歲。選取同期25例拔牙者智齒附著組織為對照組。對照組：男12例，女13例；年齡21～35歲，平均(26.9±2.0)歲。觀察組：男12例，女13例；年齡16～35歲，平均(25.7±2.3)歲。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經安陽市婦幼保健院醫學倫理委員會批準。納入研究者均簽署知情同意書。

1.2 高通量測序數據的處理高通量測序數據從National Center for Biotechnology Information(NCBI)Gene Expression Omnibus(GEO)數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲取，測序系列號為GSE37265。該數據集中共包含14例RAS患者，分別采集患者的潰瘍組織、正常組織，提取總RNA，按照Affymetrix標準操作規程對RNA進行片段化、端部修復、連接和聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增建庫，使用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array對文庫進行測序。

1.3 差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)的篩選建立篩選條件：-log10P>-log100.05；|log2Fold Change|>1。log2Fold Change>1為高表達基因，log2Fold Change<-1為低表達基因。

1.4 基因富集的分析利用DAVID在線軟件分析DEGs富集情況。DAVID被用于信號通路Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)的分析。通過DAVID軟件計算各富集組的P值。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR)取對照組和觀察組新鮮組織20 mg放入無RNA酶的離心管中，加入4 ℃預冷生理鹽水5 mL，以4 000 r·min-1轉速離心1 min，棄上清。使用4 ℃預冷磷酸鹽緩沖液洗滌，以4 000 r·min-1轉速離心1 min，棄上清。使用核酸提取儀提取總RNA。RNA水平經NanoDrop 2000檢測，OD260/OD280大于1.90可用于后續試驗。用TOYOBO試劑盒進行反轉錄，PCR管中加1 μL Random Primer，加3.0 μg提取的mRNA，用RNase Free H2O補齊至20 μL，反轉錄產物于-80 ℃保存。使用Roche combas z480進行熒光定量PCR，擴增引物由上海生工公司合成。反應體積為25 μL，ACTB為內參基因，每個基因做3個復孔，反應程序：95 ℃ 10 min，95℃ 15 s，64 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40個循環；37 ℃ 1 min。使用2-ΔΔCt法進行擴增數據分析。

2 結果

2.1 高通量測序數據中不同組織的DEGs對原始數據進行歸一化處理，并對對照組和觀察組的基因表達進行t檢驗分析，共計1 645個DEGs滿足篩選條件(-log10P>-log100.05且|log2Fold Change|>1)，其中高表達1 082個，低表達563個。見圖1。

圖1 符合篩選條件的基因倍數與P值負對數分布圖

2.2 DEGs功能分布情況使用DAVID軟件分析DEGs富集最多的5個信號通路為細胞因子-細胞因子受體相互作用通路、PI3K-Akt信號通路、趨化因子信號通路、癌癥通路、單純皰疹病毒感染通路。見表1。

表1 GSE37265中DEGs富集的信號通路情況

2.3 候選基因的篩選情況DEGs導入STRING數據庫進行分析。在蛋白間相互作用(protein-protein interaction，PPI)關系網中，39個基因編碼PPI置信度大于0.995，見表2。39個基因被篩選為候選基因，用于進一步驗證。

表2 GSE37265 DEGs編碼蛋白PPI分析

2.4 qPCR驗證候選基因結果經驗證，觀察組JAK2mRNA相對表達量低于對照組，STAT3mRNA、IL-6mRNA、SOCS3mRNA、CXCR4mRNA相對表達量均高于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 qPCR驗證候選基因mRNA表達情況

3 討論

RAS的發病機制尚未完全明確。研究表明，RAS發病與免疫、遺傳和環境等多種因素有關[6]。維生素B12、葉酸、鋅缺乏以及吸煙、精神壓力、激素和月經周期變化等都可誘發RAS[7]。其發病無顯著季節性，具有自限性、復發性和周期性等特點，炎癥病灶的潰瘍面積不大，病灶中心位置可見表面覆蓋假膜的凹陷[8]。

以往研究表明，RAS患者外周血中細胞免疫指標CD4、CD4/8、CD16+56水平低于對照組，血清免疫指標IgM、CH50、IL-6水平高于對照組，提示RAS患者疾病期細胞免疫功能降低，體液免疫功能發生紊亂[9]。本研究報道JAK2、STAT3、IL-6、SOCS3、CXCR4等多個基因在病灶組織中表達異常，這與以往其他類型炎癥性疾病中發現的DEGs一致[10]。本研究報道的異常表達基因可參與細胞因子-細胞因子受體相互作用通路、PI3K-Akt信號通路、趨化因子信號等多個信號轉導通路，與機體免疫功能的調控密切相關。RAS表現為復發性炎癥性潰爛，參與炎癥過程的細胞因子表達異常或信號通路調節紊亂都不利于RAS的控制。以往研究發現，JAK2和STAT3廣泛表達于多種細胞與組織中，是JAK/STAT信號通路中的關鍵調控因子，與多種疾病發生發展密切相關[11]。本研究證實JAK2mRNA、STAT3mRNA相對表達量與對照組有顯著差異，JAK2和STAT3編碼蛋白表達量變化及其磷酸化程度將對RAS炎癥過程產生重要影響，根據JAK2和STAT3編碼蛋白活化情況調控其表達，糾正信號通路轉導狀態將有利于RAS的控制。SOCS3可通過占據受體磷酸化酪氨酸位點，競爭性阻斷STAT3對受體的招募；SOCS3可與JAK家族蛋白結合，特異性抑制JAK激酶活性，且SOCS3及其蛋白家族其他成員可介導JAK家族蛋白泛素化降解，從而抑制JAK2/STAT3信號通路轉導，導致細胞與組織正常免疫穩態被打破，產生一系列炎癥相關疾病[12]。IL-6是由白細胞產生的細胞因子，在免疫細胞中成熟活化，通過血液運輸至靶細胞發揮調節作用。CXCR4參與JAK2和STAT3磷酸化過程。藥物調節IL-6/JAK2/STAT3信號通路有助于緩解炎癥，促進受損黏膜的修復，減輕組織中炎癥細胞浸潤[13]。研究表明，黃芪建中湯具有抑制潰瘍的作用，可能通過激活JAK2/STAT3通路，調節免疫屏障功能[14]。針對該病的分子靶點藥物尚未開發應用，檢測病灶組織中的分子指標或血清標志物有助于判斷疾病預后。目前，對于RAS的治療仍以抑制炎癥進展、緩解疼痛、降低復發率、延長疾病發作間歇期為目的。基礎醫學的進步將有助于RAS的治療和精準防控，進一步闡明RAS疾病進展的機制是精準治療的前提。炎癥性疾病涉及的信號通路復雜，涉及的分子較多，從發病機制入手糾正RAS病程中分子網絡狀態將有助于實現根治目標。以往研究提示，糾正細胞或者組織分子網絡應綜合評估采取措施的安全性[15]，深入挖掘對于RAS進展影響大的致病因子是未來研究的方向。

檢測RAS相關基因有望為解釋疾病發生發展機制提供數據支撐。本研究由于樣本量較小并且未建立動物模型，基因表達差異的調控機制尚未得到深入解釋，更大樣本量和動物模型的建立將有助于基因轉錄調控機制的研究。