石油降解菌篩選及應(yīng)用研究

鄢雨朦

(遼寧大學 環(huán)境學院，遼寧 沈陽 110031)

1 引言

在石油生產(chǎn)運輸和使用過程中，由于操作不當或意外事故導(dǎo)致石油泄漏，會對環(huán)境造成嚴重污染。近年來受石油污染的土地面積不斷擴大，污染程度也日益嚴重。由于石油的主要成分有烷烴、苯、甲苯、二甲苯等多種復(fù)雜芳香烴，這些物質(zhì)毒性大，有的有致癌致突變作用，進入土壤后難以去除，而且會隨著徑流進入周圍的流域、地下水、油田及周圍的生態(tài)環(huán)境中，帶來了嚴重的環(huán)境問題[1]。有害的石油污染物經(jīng)食物鏈富集在人體內(nèi)，還會對人體造成嚴重的損傷[2]。

石油造成的土壤污染通常采用物理和化學方法去除，前者通過焚燒而破壞大部分有機污染物，這種方法費用高，不利于處理；后者采用化學浸提，效果較好，但因易造成二次污染而受到限制[3]。為治理石油污染的土壤，石油降解菌的發(fā)現(xiàn)，為石油污染的治理提供了新思路新方法。石油污染的生物修復(fù)技術(shù)由于生產(chǎn)費用低、不產(chǎn)生二次污染而被視為一項具有廣闊前景的高新技術(shù)。

2 實驗材料

(1)石油無機鹽培養(yǎng)基：K2HPO46 g，KH2PO46 g，(NH4)2SO46 g，NaCl 5 g，石油1 g，pH值為7.0，蒸餾水1000 mL。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加入瓊脂15～20 g即可。

(2)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1000 mL，pH值為7. 0～7.2，121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加入瓊脂15～20 g即可。

3 菌株的篩選、鑒定及應(yīng)用

3.1 菌株的篩選

在被石油污染的土壤環(huán)境中采集土樣，稱取土樣10 g，放入盛有90 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，在室溫條件下，以180 r/min的速度震蕩20 h，震蕩后靜置。待出現(xiàn)固液明顯界面后，取土壤懸濁液用梯度稀釋法進行10-1、10-2、10-3梯度濃度稀釋[4]。分別取不同濃度梯度的上清液加入到含有石油的石油無機鹽培養(yǎng)基中進行富集，在37 ℃、120 r/min的恒溫振蕩器中培養(yǎng)7 d，循環(huán)3次。

采用平板劃線法進行分離，將在石油無機鹽培養(yǎng)基中富集后的菌株，分別用接種環(huán)蘸取少量液體在油平板培養(yǎng)基上依次劃線，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，能在石油平板上長出來的則是石油降解菌[5]，共得到6株菌，編號為1#～6#。

取各菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min恒溫振蕩器中培養(yǎng)24 h，按體積百分比5%的接種量接種到100 mL濃度為1 g/L的石油無機鹽培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min恒溫振蕩器中培養(yǎng)5 d，設(shè)置空白對照。最終發(fā)現(xiàn)6株菌降解效果有明顯差異，其中肉眼觀察接種菌株2#的培養(yǎng)基中石油呈絮狀、不粘于瓶壁，一部分漂浮在培養(yǎng)基液體表面上，一部分存留培養(yǎng)基內(nèi)使溶液懸濁，區(qū)別于接種其它株菌的培養(yǎng)基，故選用2#菌株進行后續(xù)實驗。

3.2 菌株的鑒定

3.2.1 菌株2#的形態(tài)與特征

對篩選出的菌種進行形態(tài)學觀察并進行生理生化實驗[6]。菌落呈圓形，邊緣整齊，表面光滑，有光澤，淡黃色半透明。顯微鏡下觀察菌體為球狀，革蘭氏染色結(jié)果為陽性。菌株有排油效果，能分解葡萄糖產(chǎn)酸，具有過氧化氫酶性，對淀粉起水解作用。

3.2.2 16SrDNA測序

16SrDNA測序由生工生物(上海)股份有限公司完成，測序結(jié)果在Gen Bank上與已知種屬的16SrDNA進行BLAST，對獲得的同源序列進行分析并構(gòu)建進化樹。系統(tǒng)進化樹如圖1所示，參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[7]和《伯杰細菌鑒定手冊》[8]，對菌株2#進行16SrDNA測序，然后進行同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)的16SrDNA序列的同源性為99%。因此結(jié)合生理生化指標可得，菌株2#歸屬于陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)。

圖1 菌株的進化樹

3.3 菌株降解石油的應(yīng)用

稱取1 g石油溶于100 mL石油醚中，作為基準用油；分別稀釋至0.2、0.1、0.02、0.01、0.001、0.002 g/L，用紫外分光光度計測定其吸光度[9]，作出原油濃度—吸光度標準曲線，得到回歸方程為y=0.019x+0.0322。

按體積百分比，分別投加1%、3%、5%、7%、10%的陰溝腸桿菌到100 mL石油濃度為1 g/L的無機鹽培養(yǎng)基中，設(shè)置空白對照，在35 ℃、160 r/min恒溫振蕩器中培養(yǎng)5 d。肉眼可見接種菌株的培養(yǎng)基中的石油呈絮狀，一部分絮狀石油漂浮在培養(yǎng)基液體表面，還有一部分留在培養(yǎng)基內(nèi)部使溶液呈懸濁狀態(tài)，與空白對照有明顯差別。以石油醚為參比液測定吸收值，將測得的吸收值在標準曲線上對照查得含油量，計算菌株2#的石油降解率。不同菌株接種量降解石油的效果也不同，結(jié)果如圖2所示。

圖2 菌株投加量與石油降解率關(guān)系

由圖2可見，實驗得到的菌株2#對石油具有明顯的降解作用，菌株投加量為1%(體積百分比)時降解效果最好，培養(yǎng)5 d后降解率可達到26.41%。

4 結(jié)語

從石油污染土壤中分離到一株石油降解菌2#，經(jīng)16SrDNA測序鑒定為陰溝腸桿菌屬，該菌能將石油作為唯一碳源進行代謝活動。采用該菌降解石油，菌株投加量為1%時能夠達到最佳降解條件，將此菌株應(yīng)用于石油污染的治理中，菌體在降解石油后，其菌體本身可通過自然降解而去除，不僅可用于處理被石油污染的環(huán)境，還不會對環(huán)境產(chǎn)生二次污染。這些結(jié)果為進一步采用該菌修復(fù)石油污染的土壤奠定了基礎(chǔ)。