七甲川菁染料與醋酸阿比特龍的化合物應用于小鼠前列腺癌的活體成像和治療研究*

譚鄧旭 馬帥軍 吳朋朋 張彩勤 趙 勇 白 冰 秦 靖 師長宏

(空軍軍醫大學實驗動物中心，西安 710032)

前列腺癌是男性泌尿系統最常見的腫瘤之一，全球發病率僅次于肺癌排名第二[1-3]。在北京、上海、廣州等經濟發達地區，前列腺癌發病率已躍居男性泌尿生殖系統惡性腫瘤首位[4]。初診前列腺癌患者大多屬于激素依賴性，隨著雄激素剝奪治療和病程進展，幾乎都會發展為去勢抵抗性前列腺癌[5]。盡管在篩查和治療局部疾病方面取得了進展，但晚期前列腺癌仍然無法治愈。手術或化學去勢等策略在過去60多年一直是前列腺最有效治療方法[6]，但近幾年的研究表明，前列腺癌可能會產生內分泌雄激素，通過AR基因突變和/或擴增的類固醇水平可支持腫瘤的持續生長[7-8]。實際上，去勢抵抗性前列腺癌患者在現有治療方案中預后是有限的，因此迫切需要研發創新藥物。

雄激素受體阻滯劑在前列腺癌治療中表現出的效果[9-11]吸引科學家對新療法產生濃厚興趣，目前在臨床前和臨床研究都集中開發有效的抗雄藥物。抗雄激素藥CYP17抑制劑——醋酸阿比特龍(abiraterone acetate，ABi)在不同階段均具有抗雄激素作用，并在臨床試驗中取得了不錯的療效[12-15]。臨床實驗發現，醋酸阿比特龍能夠顯著下調患者tPSA、睪酮水平，改善患者前列腺功能，緩解病情進展。本實驗室前期研究發現，七甲川菁近紅外熒光染料(IR-783和DZ-1)在肝癌、胃癌等腫瘤的PDX模型中有很好的腫瘤靶向性[16-20]，因此，本研究設計將七甲川菁近紅外熒光染料DZ-1和IR-783分別與醋酸阿比特龍進行共軛連接，研究其化合物在前列腺腫瘤的治療及其在小動物活體成像中的應用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物及環境：5～6周齡SPF級雄性裸鼠30只，體質量22～25 g，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(蘇)2016-0010。飼養于空軍軍醫大學實驗教研保障中心實驗動物室SPF級屏障設施中，實驗動物使用許可證號：SYXK(陜)2018-001。環境溫度23～25 ℃，相對濕度40%，12 h/12 h晝夜交替，飼喂江蘇協同生物無菌飼料，飲用水經高壓滅菌處理，動物自由攝食和飲水。

1.1.2倫理審查及腫瘤標本：本研究動物實驗通過第四軍醫大學實驗動物福利及倫理委員會批準，編號：19027。前列腺癌腫瘤標本(編號：B45354)來自空軍軍醫大學西京醫院，腫瘤標本的獲取經過患者本人及家屬同意，并簽署知情同意書，僅供實驗研究。人體標本實驗通過西京醫院醫學倫理委員會的批準(批準編號：2016317)。

1.1.3試劑及藥物：Caliper Lumina Ⅱ小動物光學成像系統(Caliper)；高效液相-電噴霧-離子井/飛行時間串聯質譜儀(shimadzu)；UV-1900(島津國際貿易有限公司)；熒光分光光度計FL8500(PerkinElmer)。

醋酸阿比特龍(Johnson & Johnson)；DZ1-ABi、783-ABi(北京泛博生物化學有限公司化學合成)；異氟烷麻醉劑(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；細胞培養基(Thermo Fisher)；PC-3、 C4-2及LNcaP(ATCC)。

1.2 方法

1.2.1化合物合成:委托北京泛博生物化學有限公司在冰水浴氮氣保護條件下加入飽和氫氧化鋰(36.64 mg，1.53 mmol，FW=23.95)，室溫反應24 h鹽酸調節pH 2～3析出醋酸阿比特龍，對七甲川菁染料和醋酸阿比特龍在不同位點進行連接，其產物分別為DZ1-ABi和783-ABi。使用高分辨率質譜對兩種產物進行結構表征檢測，使用紫外分光光度計和熒光分光光度計檢測兩種新合成化合物紫外吸收光譜以及熒光光譜。

1.2.2MTT檢測藥物作用后細胞增殖抑制率:在37 ℃、5%CO2的加濕培養箱中，在10%胎牛的RPMI-1640加入青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 μg/mL)培養人前列腺癌細胞PC-3、 C4-2、LNcaP。收集對數期細胞鋪板96孔板，調整細胞濃度為2 000個/孔(邊緣孔用無菌PBS填充)，孵育至細胞貼于孔底(96孔平底板)。用完全培養基稀釋藥物至不同的濃度(160 μmol/L、80 μmol/L、40 μmol/L、20 μmol/L、10 μmol/L、0 μmol/L)，每個濃度設8個重復孔， 100 μL/孔，孵育72 h，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5% MTT)，繼續培養3 h。培養結束，小心吸去孔內培養液，加入二甲基亞砜150 μL/孔，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD450 nm處測量各孔的吸光值。同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜)。

1.2.3實驗分組及藥物治療:將人前列腺癌PDX(B45354)皮下移植裸鼠，待瘤組織長至90～120 mm3時，隨機分為4組(n=5)：對照組(control)、ABi組、DZ1-ABi組以及783-ABi組，參考ABi的給藥方式和劑量[15]，三種藥物均按照0.15 mmol/kg灌胃，1次/d，連續30 d。利用游標卡尺測量腫瘤體積，每5天測量一次，分別測量皮下腫瘤的長度(l)和寬度(w)，腫瘤體積(V)，計算公式為：V=1/2×(w2×l)。

1.2.4活體成像監測DZ1-ABi和783-ABi體內代謝分布狀況：將前列腺癌細胞PC-3(1×106個/只)皮下移植裸鼠，待腫瘤生長至300～500 mm3分別注射DZ1-ABi和783-ABi(0.1 nmol/只)，通過Caliper Lumina Ⅱ小動物光學成像系統分別監測2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，7個時間點染料在小鼠體內代謝情況，觀測腫瘤部位近紅外熒光面積和強度(激發/發射：745 nm/ICG)。

2 結果

2.1 化合物的合成與表征

DZ1-ABi和783ABi合成路徑如圖1A所示。我們分別對新和成兩種化合物DZ1-ABi(FM=1 067.8)和783-ABi(FM=1 127.61)進行了質譜檢測(圖1B)，證實該化合物化學結構。在PBS、5%FBS和DMSO不同溶劑分別測定DZ1-ABi(100 μmol/L)和783-ABi(100 μmol/L)光學特征(圖1C)，結果顯示，兩種化合物在不同溶劑中的吸收峰均在780～800 nm，但是兩種化合物在不同溶劑紫外吸收峰值不同，且在同一介質中，DZ1-ABi明顯高于783-ABi。兩種化合物溶解于PBS(100 μmol/L)進行熒光檢測發現DZ1-ABi發射峰值在836 nm，783-ABi僅在813 nm，且同一濃度DZ1-ABi熒光信號明顯強于783-ABi，我們將兩種染料放置在EP管內用活體成像設備驗證了這一結果(圖1D)。

圖1 DZ1-ABi和783-ABi化合物的合成及其表征檢測Fig.1 Synthesis, characterization and detection of DZ1-ABi and 783-ABi compounds

2.2 MTT檢測藥物作用細胞增殖抑制率

結果如圖2所示。通過MTT法檢測結果表明：抑制腫瘤細胞增殖對藥物劑量有一定依賴性，并且發現藥物濃度在20～40 μmol/L時DZ1-ABi 表現出明顯的腫瘤抑制作用，抑制效果顯著優于783-ABi和ABi。

2.3 藥物療效評價

三種化合物的療效通過抑制腫瘤的體積大小進行評估，結果顯示三種藥物相較于對照組都有明顯的腫瘤治療效果，但DZ1-ABi治療組結果揭示更為顯著的腫瘤抑制作用(圖2D)。

2.4 動態監測化合物染料的代謝分布

實驗結果顯示，DZ1-ABi從4 h后開始在腫瘤上聚集，隨著時間推移皮下腫瘤部位的熒光特異性逐漸增強，783-ABi始終未能表現腫瘤的特異靶向性，并且在熒光強度上，DZ1-ABi也遠高于783-ABi(圖3A)。利用ROI計算藥物代謝24 h內單位面積腫瘤的熒光強度，DZ1-ABi和783-ABi在統計學上有顯著差異(P<0.01)(圖3B)。

圖2 三種化合藥物在細胞模型和PDX模型中的療效評價注：A.三種化合物對腫瘤細胞PC-3的作用；B. 三種化合物對腫瘤細胞C4-2的作用；C. 三種化合物對腫瘤細胞LNcaP的作用；D. 三種藥物抑制PDX(B45354)腫瘤的體積變化Fig.2 Evaluation of the efficacy of three chemical compounds in cell model and PDX modelNote：A. The effect of the 3 compounds on the PC-3 cell; B. The effect of the 3 compounds on C4-2 cell;C. The effect of the 3 compounds on LNcaP cell; D. Three compounds inhibit the volume change of PDX (B45354) tumor

圖3 DZ1-ABi和783-ABi在小動物活體成像檢測結果注：A.DZ1-ABi和783-ABi在前列腺癌PDX皮下模型中的活體成像；B. 化合物代謝24 h后DZ1-ABi和783-ABi在單位面積的熒光強度對比Fig.3 DZ1-ABi and 783-ABi in the live imagingNote: A. Living imaging results of DZ1-ABi and 783-ABi on PDX subcutaneous model of prostate cancer;B. Comparison of fluorescence intensity per unit area of DZ1-ABi and 783-ABi after 24 hours of compound metabolism

3 討論

根治性前列腺切除仍然是治療前列腺最有效的手段，但在高風險或轉移性患者中優先考慮放射療法、化學療法和雄激素剝奪療法[21-24]。近年來，越來越多的研究集中在開發新型多功能藥物上，這些藥物可以同時實現癌癥診斷和個性化治療[25]。醋酸阿比特龍是一種CYP17抑制劑，可改善接受或不接受多西他賽治療的前列腺癌患者的總體生存率[26]。除可以抑制CYP17外，醋酸阿比特龍也是雄激素受體的拮抗劑，可以抑制3β-羥基類固醇脫氫酶[27-28]，對表達高水平雄激素受體并合成自身雄激素的前列腺癌有抗腫瘤作用[29]。

本研究將醋酸阿比特龍和七甲川菁近紅外熒光染料在不同位點進行連接獲得兩種化合物DZ1-ABi和783-ABi，使用高分辨率質譜和紫外分光光度計對其進行結構表征檢測，證實其化學結構的準確性且具有熒光屬性。MTT結果顯示，DZ1-ABi對腫瘤細胞的抑制作用顯著優于783-ABi和ABi。為了證實DZ1-ABi的腫瘤抑制效果，我們在動物體內選擇更具有異質性并且更接近臨床樣本的前列腺PDX模型(B45354)進行藥效實驗。結果同體外細胞實驗結果一致，實驗結果表明DZ1-ABi化合物在前列腺癌治療中的潛力。小動物活體成像檢測結果更清楚地研究新合成的兩種具有近紅外熒光屬性化合物的體內代謝和分布情況，我們設計了給藥2～72 h的連續活體成像監測，DZ1-ABi從4 h開始在腫瘤部位的特異性富集可持續至72 h，其對前列腺癌成像的高特異性在前列腺癌患者的早期診斷、轉移灶篩查等具有一定的臨床應用前景。

化合物在結構上表現出不同位點的鏈接，其化學光學特性不盡相同，因此通過以上研究，不論是在體外細胞水平還是體內動物實驗結果，DZ1-ABi均表現出顯著的抑制腫瘤的優勢，同時兼具了七甲川菁近紅外熒光染料的成像診斷功能和醋酸阿比特龍的治療作用，是具有前列腺癌成像和治療雙重功能的新型藥物，且顯示出作為理想的化療藥物可同時實現腫瘤診斷成像的巨大潛力。本實驗室將通過更多的前列腺癌PDX模型進一步驗證研究DZ1-ABi的診斷和治療效果。