孕期營養(yǎng)補充劑對妊娠母鼠和仔鼠行為學影響*

張長勇 白兢毳 暴 國 何嘉玲 李 楠 王尚明 張 斌 張樹成 孫德明 王 寧 王天奇*

(1. 國家衛(wèi)生健康委科學技術研究所，北京 100081)(2. 北京市朝陽區(qū)太陽宮社區(qū)衛(wèi)生服務中心，北京 100028)

孕母與胎兒的關系十分密切，任何影響母親健康發(fā)育的因素都有可能同時影響胎兒發(fā)育，進而影響子代的健康[1]。孕期營養(yǎng)尤為重要，因為圍生期是生命過程中對營養(yǎng)狀況最為敏感的時期，胎兒生長發(fā)育所需的營養(yǎng)來自母體，孕期均衡營養(yǎng)是胎兒生長發(fā)育的基礎，孕期營養(yǎng)不良和營養(yǎng)過剩均影響胎兒生長發(fā)育[2]。中樞神經系統(tǒng)的發(fā)育和智力水平取決于3個重要因素：遺傳、環(huán)境和營養(yǎng)。人體必需微量元素在人體內具有重要功能，它們具有高度的生物活性，是維持正常生命活動所必須，其中主要是參與多種酶的組成和激活，但其作用又是相當復雜的，它與人體生理、病理的改變都有密切的關系[3]。微量元素之間能夠互相影響，有拮抗或協(xié)同作用，微量元素含量不足或過多對機體均可產生不良影響，胎兒出生低體質量，成人后高血壓、冠心病、卒中和糖尿病率和死亡明顯增高[4]。近年來，關于微量元素對胎兒及新生兒生長發(fā)育的作用已受到廣泛的關注。胎兒期是中樞神經系統(tǒng)發(fā)育最快也是最容易受外界影響的時期，腦細胞在這一時期對營養(yǎng)不良非常敏感，胎兒期營養(yǎng)不良比出生后營養(yǎng)不良對智力的影響更大更持久。曠場試驗是在自然狀態(tài)下觀察實驗動物的活動情況，主要用于評價實驗動物的運動功能、探究行為和情緒反應等，在神經精神藥理學和行為藥理學的研究領域中廣泛應用[5-6]。本研究用昆明小鼠為研究對象，通過曠場行為實驗，觀察產后孕鼠和子代小鼠的探索行為，同時觀察出生后小鼠體質量的變化和低體質量發(fā)生率的比較，研究孕期添加營養(yǎng)補充劑對母鼠和子代小鼠行為能力、以及對仔鼠生長發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級昆明雌鼠40只，雄鼠20只，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK-(軍)2007-004。飼養(yǎng)于國家衛(wèi)生健康委(原衛(wèi)生計生委)科學技術研究所實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2018-0010。雌雄比例2∶1交配后懷孕母鼠進行灌胃處理，仔鼠21 d離乳后對母鼠進行曠場實驗測試；仔鼠離乳后一周隨機選取雌雄各20只進行曠場實驗測試。

1.2 方法

1.2.1藥物劑量與分組:樸美牌多種維生素多種礦物質片(北京紫竹藥業(yè)有限公司)，即孕期營養(yǎng)補充劑的孕早期、孕中期、孕晚期產品(生產批號分別為20121203、20120909、20121102)。

SPF級昆明小鼠交配見栓后隨機分為低劑量組、中劑量組、高劑量組和溶劑對照組，孕期添加營養(yǎng)補充劑(孕早期、孕中期、孕晚期3個階段的產品)按人體推薦日攝入量2 g/d換算小鼠的等效劑量，以等效劑量的0.5倍、1倍、2倍作為低、中、高3個劑量組的藥物劑量，分別為150 mg/(kg·d)、300 mg/(kg·d)、600 mg/(kg·d)，連續(xù)灌胃6 d，休息1 d后使用下一階段產品，直至生產。即3個劑量組均在見栓第1～6天使用孕早期營養(yǎng)補充劑，第8～13天使用孕中期營養(yǎng)補充劑，第15～20天使用孕晚期營養(yǎng)補充劑，溶劑對照組灌胃等劑量的溶劑安慰劑。

1.2.2仔鼠體質量監(jiān)測:記錄仔鼠出生、21 d離乳時和離乳后一周的體質量。

1.2.3曠場實驗:采用立方形灰色木質曠場箱，其底面為灰色，用黑線劃分為25個正方形格(20 cm×20 cm)，分為沿側壁的16個外周格，其余為中心9個中央格，攝像頭置于中央格正上方。所有的實驗都在08：00～12：00完成。實驗時將動物放入箱內底面中心，實驗人員遠離曠場箱，同時進行攝像5 min，每次實驗結束后用酒精清洗方箱內部，以免影響下次測試。實驗完成后，觀看5 min內小鼠自發(fā)的水平運動(穿過方格的次數(shù))和垂直運動(直立)的次數(shù)。

1.3 統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)使用 SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，進行獨立樣本方差分析，采用Dunnett-t檢驗。與對照組比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 仔鼠出生體質量、離乳體質量和離乳后一周體質量的比較

仔鼠出生體質量的比較見表1所列。孕鼠每胎(窩)仔鼠出生體質量在低劑量組、中劑量組和高劑量組呈增加趨勢，其中高劑量組在雌性、雄性仔鼠和總的仔鼠的出生體質量與溶劑對照組比較均明顯增加(P<0.05)，雌性仔鼠、雄性仔鼠和總的仔鼠分別增加11.96%、13.30%和12.26%。提示妊娠期母鼠補充多種維生素和礦物質營養(yǎng)補充劑出生仔鼠體質量增加。

表1 出生仔鼠體質量的比較Table 1 Comparison of birth weight

離乳和離乳后一周仔鼠體質量見表2所列。哺乳21 d后，3個實驗組仔鼠體質量較對照組明顯增加(P<0.05，P<0.01)；其中，雌性仔鼠在三組中分別增加4.78 g、4.93 g和12.57 g；雄性為7.69 g、8.64 g和11.11 g。平均每只仔鼠增加為6.21 g、6.89 g和11.79 g。離乳后一周后，3個實驗組仔鼠體質量較對照組明顯增加(P<0.01)。其中，雌性仔鼠在三組中的體質量分別增加13.87 g、13.65 g和16.11 g；雄性分別增加18.60 g、19.95 g和20.68 g；平均每只仔鼠體質量增加16.79 g、17.31 g和19.09 g。

表2 離乳及離乳后一周仔鼠體質量變化的比較Table 2 Comparison of body weight changes of weaners and 1 week after weaning

2.2 對產后孕鼠自主活動的影響

母鼠于產后(25～30 d)進行曠場實驗測試(表3)。與溶劑對照組比較，高劑量組行為學分析的自主活動參數(shù)測試顯示，在水平運動和垂直運動兩項分析指標無明顯變化(P>0.05)，在中央?yún)^(qū)停留時間及穿越中央?yún)^(qū)次數(shù)兩項分析指標有增加的趨勢，分別增加33.02%和28.11%，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示孕期給予高劑量營養(yǎng)補充劑具有增加孕鼠產后探索行為的趨勢。

表3 對產后母鼠自主活動的影響(n=10)Table 3 Effect on the voluntary activity of postpartum female rats (n=10)

2.3 對仔鼠自主活動的影響

對雌性小鼠自主活動的影響見表4所列。與溶劑對照組比較，雌性仔鼠水平運動和垂直運動指標無明顯差異(P>0.05)，但水平運動指標顯示在中劑量和高劑量組分別增加5.16%和14.79%；在中劑量和高劑量組中央?yún)^(qū)停留時間分別增加4.59%和72.95%，高劑量組明顯增加(P<0.01)；穿越中央?yún)^(qū)次數(shù)分別增加8.58%和56.89%，高劑量組明顯增加(P<0.05)。

表4 說明孕期給予高劑量營養(yǎng)補充劑具有明顯提高雌性仔鼠(n=20)Table 4 Effect on autonomous activity of female filial mice(n=20)

對雄性仔鼠自主活動的影響見表5所列。與溶劑對照組比較，雄性仔鼠水平運動指標無明顯差異(P>0.05)；垂直運動指標在中劑量和高劑量組明顯增加(P<0.01和P<0.05)，分別增加47.06%和59.65%；在3個實驗組中，中央?yún)^(qū)域停留時間及穿越中央?yún)^(qū)域次數(shù)均具有增加趨勢，分別增加21.87%、26.44%、27.88%及37.27%、35.98%、10.40%，但無明顯差異(P>0.05)。說明孕期給予中劑量和高劑量營養(yǎng)補充劑，具有明顯提高雄性仔鼠對新鮮環(huán)境的好奇程度和探究行為的作用。

表5 對雄性仔鼠自主活動的影響(n=20)Table 5 Effect on autonomous activity of male filial mice (n=20)

3 討論

微量元素(如鈣、鐵、鋅、鎂和銅)是人體必需的物質。孕期母體一種或多種物質攝入不足都將影響自身新陳代謝以及機體功能等，同時對胎兒的生長發(fā)育和成熟也將產生間接影響，導致胎兒發(fā)育障礙[7]。妊娠各個時期的胎兒生長發(fā)育有所不同，所需的微量元素和維生素也有所不同，所以按照不同階段的需求給與一定的微量元素和維生素的補充是很有必要的[8]。

魏穎等[9]的研究顯示，孕期孕鼠補充營養(yǎng)劑可增加孕鼠體質量，保證胚胎各主要器官如心臟、大腦、脊椎骨發(fā)育，另外有實驗結果[10]顯示孕期營養(yǎng)不良可影響胎兒重要器官發(fā)育，導致大腦結構和功能變化，進而表現(xiàn)為認知功能、學習記憶能力等方面永久性受損。本研究結果顯示，孕期補充多種維生素和礦物質能夠增加仔鼠出生、離乳和離乳一周體質量，說明在孕期給與母鼠多種維生素和礦物質補充劑能夠促進仔鼠發(fā)育。

行為是觀察到的動物對環(huán)境的反應，是對變化環(huán)境條件的適應活動。隨著生活環(huán)境條件的改變或受到外界環(huán)境的刺激后，動物會在中樞神經系統(tǒng)控制下，做出一系列的行為反應(向性、趨性、反射、本能、學習和推理)[11]。曠場行為主要檢測動物活動度及興奮性、對新環(huán)境的探索、習慣化以及伴隨的情緒變化[12]。本研究采用曠場實驗方法，動態(tài)分析動物在曠場的活動軌跡，可以提取客觀定量數(shù)據(jù)。該實驗評價的指標包括實驗動物的水平運動、垂直運動、中央?yún)^(qū)域停留時間及穿越中央?yún)^(qū)域次數(shù)等指標。水平運動的減少提示，大鼠活動度的降低，垂直運動的減少提示動物對新鮮環(huán)境的好奇程度降低。動物因對新鮮開闊環(huán)境的恐懼表現(xiàn)出主要在周邊區(qū)域活動，中央?yún)^(qū)域活動減少的特性，但動物的探究行為又促使其向中央?yún)^(qū)域活動，因此中央?yún)^(qū)域活動時間及次數(shù)代表實驗動物的探索行為[5]。陳貴海等[13]在對年齡及性別對小鼠新物體再認能力的研究中，發(fā)現(xiàn)老年雌性小鼠要比老年雄性小鼠有對新物體再認(短期記憶)能力下降。另外有研究顯示[14-15]，適量補充維生素可提高機體的適應能力。本研究結果顯示孕鼠添加營養(yǎng)補充劑對雌鼠水平運動和垂直運動影響不明顯，但可增加其在中劑量和高劑量組中央?yún)^(qū)停留時間，分別增加4.59%和72.95%，高劑量組明顯增加(P<0.01)；穿越中央?yún)^(qū)次數(shù)分別增加8.58%和56.89%，高劑量組明顯增加(P<0.05)，說明孕期給予高劑量營養(yǎng)補充劑具有明顯提高雌性仔鼠探索行為的作用，但在雄性仔鼠中，孕鼠添加營養(yǎng)補充劑可明顯增加中劑量組和高劑量組垂直運動水平(P<0.01和P<0.05)；中央停留時間和穿越中央次數(shù)有增加的趨勢，但沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)，說明孕期給予中劑量和高劑量營養(yǎng)補充劑，具有明顯提高雄性仔鼠對新鮮環(huán)境的好奇程度和探究行為。在對母鼠的研究結果中可以看到，斷奶后一周母鼠的水平運動和垂直運動兩項指標沒有明顯變化，但在中央?yún)^(qū)停留時間及穿越中央?yún)^(qū)次數(shù)兩項分析指標有增加的趨勢，分別增加33.02%和28.11%，提示孕期給予高劑量營養(yǎng)補充劑具有增加孕鼠產后探索行為的趨勢；減小產后發(fā)生抑郁的可能性。

綜合以上研究結果，與溶劑對照組相比，孕期添加營養(yǎng)補充劑具有增加產后孕鼠、仔鼠垂直運動及中央?yún)^(qū)域運動次數(shù)及時間的作用，而對實驗動物的水平運動無明顯影響，提示孕期營養(yǎng)補充劑能夠在不增加實驗動物自主活動的情況下，增加其探索行為。