miRNA-125a靶向調控Bcl-2對癲癇大鼠神經元凋亡的影響

裴 靜 陳 明 高 華 白 楊 王 萍

(新疆醫科大學第五附屬醫院神經內科，烏魯木齊 830000)

癲癇是一種臨床上表現為反復性、刻板性、暫時性及發作性的腦部疾病。由于感覺、意識、精神、運動、行為等發生了功能性障礙，給患者帶來沉重的心理及生理負擔[1-2]。microRNAs(miRNAs)是一組不具有編碼功能的小分子RNA，通過調控轉錄后水平的基因表達參與細胞調控，有研究表明其可能涉及癲癇發生發展的過程[3]。miRNA-125a可在多種疾病中發揮重要作用，如癌癥、心血管疾病和自身免疫性疾病等，并通過調節凋亡相關基因對細胞增殖和凋亡產生重要影響[4-6]。因此，本研究探討miRNA-125a對癲癇大鼠神經元凋亡的影響，為臨床治療癲癇提供新的思路及理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選擇清潔級SD雄性大鼠32只，8～12周，體質量200～240 g，購自中國科學院昆明動物研究所，實驗動物生產許可證號：SCXK(滇)K2016-0001。將32只大鼠隨機分為4組，正常對照組(A組)、癲癇組(B組)、miRNA-125a antagomir control組(C組)、miRNA-125a antagomir組(D組)。

1.2 實驗主要試劑

miRNA-125a antagomir、antagomir NC(廣州銳博生物科技有限公司)；TUNEL原位凋亡檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；熒光素酶檢測試劑盒(Promega)；Trizol(Invitrogen)；miR-125a、U6、Bcl-2、GAPDH qPCR上下游引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]；Bcl-2兔單克隆抗體、β-actin兔單克隆抗體、山羊抗兔二抗(Santa)。

1.3 建立動物模型

采用經典的氯化鋰-匹羅卡品注射法[7]：腹腔注射127 mg/kg的氯化鋰，12 h后腹腔注射10 mg/kg溴化甲基阿托品，30 min后再次腹腔注射100 mg/kg的匹羅卡品。經典癲癇發作標準分為6級：0級：實驗大鼠無任何異常反應；Ⅰ級：大鼠出現面部節律性抽動；Ⅱ級：大鼠出現甩尾或是點頭行動；Ⅲ級：大鼠某一肢體出現抽動動作；Ⅳ級：大鼠軀體僵直或是四肢抽動；V級：大鼠完全僵直，并出現陣攣。大鼠癲癇發作在Ⅳ級以上且發作解除后狀態良好，則癲癇大鼠模型建立成功。正常對照組：采用等量生理鹽水代替氯化鋰-匹羅卡品，其他處理方式與癲癇組相同；癲癇組：選擇建模成功的大鼠側腦室注射生理鹽水；miRNA-125a antagomir組：選擇建模成功的大鼠側腦室注射miRNA-125a antagomir，轉染終濃度為50 nmol/L；miRNA-125a antagomir NC組：選擇建模成功的大鼠側腦室注射miRNA-125a antagomir NC，轉染終濃度為50 nmol/L；其中，antagomir NC是含miRNA成熟體的雙鏈無功能基因序列并不表達基因功能，miRNA-125a antagomir是根據miRNA-125a成熟體設計并針對提高體內穩定性而經過特殊化學修飾的miRNA拮抗劑，發揮抑制miRNA作用。各組處理7 d后麻醉解剖大鼠。

取出大鼠腦后沿矢狀縫將腦組織一分為二。其中一側腦組織置于預冷的4% 多聚甲醛中固定，常規切片后用于HE染色及海馬神經元凋亡細胞檢測；另一側腦組織保存于-80 ℃，用于總RNA和蛋白提取。

1.4 觀察指標

1.4.1qRT-PCR檢測各組大鼠腦組織miRNA-125a表達水平:取腦組織于液氮中研磨，加入1 mL Trizol提取總RNA。采用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA，取1 μL cDNA作為模板進行qRT-PCR擴增。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃、30 s，共40個循環，最后72 ℃延伸10 min。每個樣本重復檢測3次，每組基因的相對表達量按公式(2-△△Ct法)計算。引物設計見表1。

表1 qRT-PCR擴增引物序列Table 1 Pimer sequences of qRT-PCR

1.4.2HE檢測各組大鼠腦海馬組織病理形態學改變:處死大鼠取腦分離海馬組織用0.9%生理鹽水漂洗、濾紙吸干，放入4% 多聚甲醛固定48 h，然后進行脫水、石蠟包埋、切片。病理切片厚度為4 μm。將病理切片放置于65 ℃烘箱2 h后，依次放入二甲苯10 min、無水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、50%乙醇各5 min。蘇木素-伊紅染色。中性樹脂封片，鏡下觀察腦海馬組織CA-1區形態及病理改變。

1.4.3TUNEL法檢測腦海馬神經元細胞凋亡數:將腦海馬組織切片后，采用抗原修復脫蠟，PBST洗滌3次。根據TUNEL試劑盒操作說明進行操作。用蛋白酶K(20 mg/mL)消化，滴加平衡緩沖液，孵育30 min，棄去緩沖液，滴加TdT緩沖液孵育，再孵育于TUNEL反應液中。用0.01 mol/L的PBS進行漂洗后滴加堿性磷酸酶，再用PBS漂洗。最后置于堿性磷酸酶顯色底物(NBT/BCIP)溶液中，避光顯色后在熒光顯微鏡下進行觀察，正常細胞核為藍色，凋亡細胞核為棕黃色，于高倍鏡下隨機計數10個視野，計算凋亡細胞數。

1.4.4Western blot和qRT-PCR法檢測各組大鼠腦組織中Bcl-2的表達水平:取腦組織加入預冷的RIPA裂解液，冰浴放置30 min，提取總蛋白并進行定量。進行10% SDS-PAGE電泳，將蛋白條帶轉移至PVDF膜上，分別加入含有Bcl-2抗體(1∶1 500稀釋)的脫脂牛奶中4 ℃過夜。洗膜后，加入二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h，洗膜，取適量ECL試劑顯影5 min，采用凝膠成像數碼分析系統進行定量分析。

1.4.5熒光素酶活性檢測miRNA-125a與Bcl-2的靶向關系:為進一步確定miRNA-125a與Bcl-2靶向關系，將Bcl-2的3′-UTR序列及突變后的3′-UTR序列克隆到野生型Bcl-2-3′UTR(Wt)和突變型Bcl-2-3′UTR(Mut)。將該載體和miRNA-125a模擬物共轉染N1E-115細胞，常規培養48 h后使用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光值。

1.5 統計方法

2 結 果

2.1 各組大鼠行為學觀察結果

造模后，各組均未出現大鼠死亡，B組、C組和D組大鼠均出現全身強直抖動，繼而出現反復前肢痙攣、跌倒、翻轉等，繼而進入癲癇狀態。7 d后，B組和C組大鼠出現癲癇自發發作，進食明顯減少，毛發無光澤，而D組大鼠發作次數明顯減少，進食情況及毛發均較B組和C組良好。A組大鼠一切表現正常。

2.2 各組大鼠腦組織miRNA-125a表達水平

qRT-PCR結果顯示，與A組(0.52±0.11)相比，B組(1.36±0.10)和C組(1.39±0.08)大鼠腦組織miRNA-125a表達升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；D組miRNA-125a表達(1.13±0.09)與C組相比降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織miRNA-125a表達水平注：與A組相比，*P<0.05；與C組相比，#P<0.05Fig.1 Expression level of miRNA-125a inbrain tissue of rats in each groupNote：Compared with group A, *P<0.05;Compared with group C, #P<0.05

2.3 各組大鼠腦海馬組織病理形態學

A組大鼠海馬CA-1區細胞排列整齊，細胞形態結構及層次清晰完整，核仁明顯，間質無水腫；B組大鼠海馬CA-1區可見壞死灶，細胞排列紊亂，細胞核固縮，核仁消失，細胞間隙增寬出現水腫；D組大鼠海馬CA-1區水腫現象明顯減輕，海馬細胞排列紊亂現象有所改善。見圖2。

圖2 各組大鼠腦海馬組織病理形態學(HE，×200)Fig.2 Pathomorphology of hippocampus in each group (HE，×200)

2.4 各組大鼠腦海馬神經元細胞凋亡數

光鏡下正常細胞核為藍色，凋亡細胞核為棕黃色。TUNEL結果顯示，B組(37.12±4.63)、C組(34.60±3.53)和D組(13.14±1.72)大鼠腦海馬CA-1區神經元細胞凋亡數明顯高于A組(4.06±0.55)，差異具有統計學意義(P<0.05)；與C組相比，D組大鼠腦海馬CA-1區神經元細胞凋亡數降低，差異均具有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠腦海馬神經元細胞凋亡數(TUNEL，×200)Fig.3 Apoptosis of hippocampal neurons in each group (TUNEL，×200)

2.5 各組大鼠腦組織中Bcl-2的表達水平

Western blot結果顯示，與A組相比，B組和C組大鼠腦組織Bcl-2蛋白表達降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；D組Bcl-2表達與C組相比增加(P<0.05)。qRT-PCR結果顯示，與A組(4.08±0.19)相比，B組(2.35±0.16)和C組(2.30±0.13)大鼠腦組織Bcl-2 mRNA表達降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；D組(3.31±0.19)與B組和C組相比增加(P<0.05)。見圖4。

2.6 miRNA-125a與Bcl-2的靶向關系

熒光素酶報告基因實驗結果顯示，miRNA-125a與Bcl-2基因3′-UTR存在互補結合位點，miRNA-125a和Bcl-2能夠靶向結合。轉染野生型Bcl-2基因表達載體Wt-3′-UTR后再轉染miRNA-125a抑制劑的熒光素酶活性顯著升高(P<0.05)；而轉染突變型Bcl-2基因表達載體Mut-3′-UTR再轉染miRNA-125a抑制劑的熒光素酶活性差異無統計學意義。見圖5。

圖4 各組大鼠腦組織Bcl-2蛋白和mRNA表達水平注：與A組相比，*P<0.05；與C組相比，#P<0.05Fig.4 Expression levels of Bcl-2 protein and mRNA in brain tissue of rats in each groupNote:Compared with group A, *P<0.05; Compared with group C, #P<0.05

圖5 熒光素酶報告基因實驗(n=3)注：與miRNA-125a陰性對照組相比，*P<0.05Fig.5 Luciferase reporter gene experiment (n=3)Note:Compared with miRNA-125a negative control group, *P<0.05

3 討論

癲癇是一種慢性神經系統疾病，其發病機制非常復雜且影響因素較多。miRNA-125a在細胞的分化、增殖、凋亡及新生組織的發育中有重要的調節作用[8]。miRNA-125家族的促進細胞凋亡的作用通常是通過其抑制相應的抗凋亡蛋白的表達而完成[9]。有研究發現，miR-125a在腫瘤干細胞中顯著上調，p53的mRNA和蛋白水平下調。p53基因轉染明顯降低了TW01和CSCs的細胞活力，并在G0/G1期終止細胞周期[10]。本研究采用經典的氯化鋰-匹羅卡品注射法建立癲癇大鼠模型，結果發現與正常對照組相比，模型組大鼠腦組織miRNA-125a的表達水平顯著升高；HE結果發現海馬細胞排列整齊，細胞形態結構及層次清晰完整，核仁明顯，間質無水腫；模型組可見壞死灶，細胞排列紊亂，細胞核固縮，核仁消失，細胞間隙增寬出現水腫，抑制miRNA-125a的表達后，大鼠腦組織水腫現象明顯減輕，海馬細胞排列紊亂現象有所改善。提示癲癇模型大鼠腦組織損傷可能與miRNA-125a表達水平升高有關。

目前認為癲癇與神經元死亡、神經元再生、神經膠質細胞再生等有關[11]。田茸等[12]發現，反復的癲癇發作可導致大腦海馬神經元凋亡，形成異常興奮性突觸環路，最終促進難治性顳葉癲癇形成。神經元凋亡過程受多種基因的調控，其中Bcl-2是與細胞凋亡密切相關的基因。Bcl-2主要參與細胞的內源性凋亡途徑完成對細胞凋亡的調控，是已經被證實的抑制凋亡基因[13]。姚寶珍等[3]發現，miRNA-34a在癲癇模型中表達上調，且在急性期促進Notch1的表達，導致神經元凋亡及神經膠質增多，從而促進癲癇的發生發展。金紹靜等[14]發現，癲癇大鼠海馬組織中Bcl-2表達水平降低，且CA1區神經元凋亡率增加。本研究TUNEL結果顯示，正常對照組海馬神經元細胞排列規則，神經元胞核形態正常；模型組海馬神經元細胞排列紊亂，神經元胞膜破裂，細胞脫落形成空泡，且腦海馬神經元凋亡細胞數明顯升高；此外，模型組大鼠腦組織Bcl-2表達水平與正常對照組相比明顯降低，抑制miRNA-125a表達后，Bcl-2表達水平升高，神經元排列較規則，神經元凋亡細胞數降低，提示癲癇引起的腦損傷可能與海馬神經元損傷及神經元細胞凋亡有關，抑制miRNA-125a可抑制神經元細胞凋亡，對神經元起到保護作用。

近年來研究發現，miRNA參與機體的生長、發育、分化及凋亡等生理過程的調控主要取決于其下游靶點[15]。本研究通過生物信息學進一步探討miRNA-125a與Bcl-2之間的靶向關系，結果發現抑制miRNA-125a后，Bcl-2的表達水平顯著升高，且miRNA-125a與Bcl-2基因3′-UTR存在互補結合位點，miRNA-125a和Bcl-2能夠靶向結合。提示Bcl-2是miRNA-125a的下游靶基因。

綜上所述，癲癇模型大鼠腦組織miRNA-125a可通過調控Bcl-2表達，進一步導致腦海馬神經元損傷及大量神經元細胞凋亡；抑制miRNA-125a的表達水平可改善癲癇大鼠神經元損傷。