BMSCs過表達BMP-4復合同種異體骨修復軟骨缺損*

張 飛 溫福利 黨 源 薛來恩 鄭和平

(1. 聯勤保障部隊第九○○醫院基礎醫學實驗室，福州 350025)(2. 南方醫科大學順德醫院，順德 528300)

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是最常見的軟骨退行性疾病之一，截至2017年累計影響全球2.4億人[1]。在2010年世界衛生組織全球疾病負擔研究中，OA在291種非致命但長期殘疾疾病中排名第11位[2]。調查研究顯示，81.5%患者的日常生活和工作受到影響[3]。常用治療方法包括藥物保守治療及手術治療[4]。對于輕中度患者，保守治療可一定程度上延緩病情進展，但很難修復軟骨損傷[5]；對于中重度患者，手術治療存在不可避免的缺陷，如微骨折術和軟骨下鉆孔術再生的是劣質纖維軟骨；軟骨細胞移植對全層軟骨損傷治療效果欠佳[6]，且供體來源受限，易導致供區繼發性損傷；而骨軟骨移植術存在傳播疾病及免疫排斥及供區受損等風險。

組織工程通過借助生物支架構建三維空間，在生物因子的調控下促使種子細胞向軟骨細胞分化實現軟骨再生。其中，骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchyma stem cell，BMSCs)可與軟骨誘導生物材料和生物活性因子結合，用于軟骨局灶性缺損的再生[7]。骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)可啟動間充質干細胞向軟骨細胞定向分化里程，誘導骨及軟骨形成[8]。目前，除常見的BMP-2外[9]，BMP-4能在細胞核水平對轉錄進行調控[10]，促進Ⅱ型膠原及蛋白多糖合成[11]。

本研究使用同種異體骨作為生物支架材料，通過程序性深低溫技術降低支架免疫原性，并應用BMP-4誘導BMSCs向軟骨細胞分化，以期實現關節軟骨損傷的有效修復。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：42只普通級雄性新西蘭兔，1月齡，體質量為(700±50)g，購自福建省連江玉華山自然生態農業實驗場，實驗動物生產許可證號：SCXK(閩)2014-0001，合格證編號：35002000000082。飼養于原南京軍區福州總醫院比較醫學科普通環境，實驗動物使用許可證號：SYXK(軍)2018-0003，環境溫度(21±1)℃，相對濕度45%～60%。所有操作均符合實驗動物倫理學要求，動物倫理審查批件號：IACUC-2018-011。

1.1.2細胞及實驗試劑：BMSCs原代細胞來自本課題實驗組；BMSCs軟骨(RASMX-90042)、骨(RASMX-90021)、脂肪(RASMX-90031)誘導分化培養基、茜素紅、油紅O和阿利新藍染液均購自Cyagen；鼠抗兔- IgG(bs-0295P)、CD34(bs-9752R)、CD29(bs-20630R)、CD45(bs-4818R)、 CD90(bs-20640R)均購自北京奧博森生物有限公司；CCK-8購自Genview；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自北京鼎國生物科技有限公司；大鼠抗兔GAPDH(GB11002)、BMP-4(GB11013)、Sox9(GB11045)、COLⅡ(GB11025)抗體和蘇木素Masson番紅固綠(骨組織)染液套裝均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；兔BMP-4(JM-08801R1)、Sox9(JM-08805R2)、COLⅡ(JM-00747R2)ELISA試劑盒均購自江蘇晶美生物科技有限公司；Ad-BMP-4(QPG-040)及ADV4-NC(QPG-041)購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1制備同種異體骨軟骨柱移植物:18只新西蘭白兔膝關節脫毛，溫水洗凈，下肢肌肉注射 3%戊巴比妥鈉1 mL，麻醉后仰臥位固定于操作臺上，膝關節碘伏消毒，鋪巾，膝關節呈屈曲90°。髕旁內側縱行切口約3.0 cm，逐層分離筋膜層及肌肉組織，完整暴露髕骨，推向內側，顯露股骨髁。取直徑3.5 mm橫穿釘套筒， 調整深度4.0 mm，于股骨滑車處垂直軟骨面緩慢轉動，至限定深度后停止，取出骨軟骨柱，放入含有1 mL含10% DMSO的凍存液中，縫合切口。骨軟骨柱依次于4 ℃保存2 h，-20 ℃保存6 h，液氮保存3 周備用。

1.2.2同種異體骨軟骨柱包裹Ad-BMP-4-BMSCs:消化P2代BMSCs，以MOI=100感染細胞，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。12 h后消化細胞，移入15 mL離心管中備用。復蘇骨軟骨柱，PBS洗滌2～3次后放入細胞離心管中，1 500 g，離心10 min，繼續培養12 h后取出細胞懸液中的骨軟骨柱，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達。

1.2.3建立動物模型及分組:24只新西蘭白兔，膝關節脫毛，溫水洗凈。隨機分4組：A組為單純軟骨缺損組，B組為單純生物支架組，C組為骨柱+未感染細胞組，D組為骨柱+細胞感染組，每組6只。按軟骨柱制備方法建立軟骨缺損模型，按分組條件在缺損區進行對應的干預后，生理鹽水沖洗術腔、復位髕骨、縫合切口、紗布包扎，將實驗動物編號，注明組別和日期。術后連續3 d對所有動物進行常規抗生素(青霉素+鏈霉素)肌肉注射，預防感染。

1.2.4膝關節標本取材:術后4 周、8 周、16 周分別處死A、B、C、D組各2只(4膝)實驗動物，取出雙下肢股骨頭，觀察缺損部位及周圍正常組織。標本浸泡于4%多聚甲醛固定液中，3 d后取出標本，流水清洗2～3次。浸泡于含10% EDTA的脫鈣液中，每2天更換1次脫鈣液，2～3 周后取出標本，流水沖洗2～3次。對標本采用國際軟骨修復協會組織學評分標準ICRS組織學評分進行量化分析，后進行切塊、脫水、包埋蠟塊等處理后，于切片機上切片，厚度為5 mm，于通風箱內干燥24 h后取出，分別行HE、番紅固綠、Masson及免疫組化染色，并采用Image J軟件對陽性染色區域進行定量分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 體外感染后同種異體骨軟骨柱情況

本研究制備的同種異體骨軟骨柱，直徑為3.5 mm，高度為4.0 mm。經Ad-BMP-4感染12 h后可見移植物上開始吸附綠色熒光蛋白，但分布不均，表達量較低(圖1A)，24 h后可見移植物綠色熒光蛋白表達量對比12 h明顯上升，分布較均勻，緊貼移植物表面(圖1B)。

圖1 同種異體骨軟骨柱移植物制備注：A.感染12 h后同種異體骨軟骨柱(×100)；B.感染24 h后同種異體骨軟骨柱(×100)Fig.1 Preparation of allogeneic bonecartilage column graftNote: A. Allogeneic osteochondral column 12 hours afterinfection (×100); B. Allogeneic osteochondral column24 hours after infection (×100)

2.2 膝關節標本大體觀察及評分

結果如圖2所示。4周時可見A組缺損明顯，無明顯組織形成；B、C、D組填充物多呈灰黃色。8 周時A組缺損直徑較4周縮小，但缺損處依舊無明顯組織生長；B組可見缺損中心處有白色軟骨樣組織，觸之柔軟，但與周圍組織無融合；C組可見邊界線逐漸淡出，但缺損中心明顯凹陷，且組織為淡黃色，質地較硬；D組邊界線模糊，缺損中心平整，無明顯凹陷，組織為白色軟骨樣組織。

圖2 膝關節標本取材及大體觀察Fig.2 Specimens collection and generalobservation of knee joint

16周時A組缺損逐漸填充，但軟骨面凹陷，與周圍組織融合欠佳，填充組織多為淡黃色，質地較硬纖維組織；B組缺損處軟骨樣組織填充，但與正常組織邊界較明顯，軟骨面不平整；C組邊界線明顯縮小，但中心處組織凹陷；D組缺損處組織與周圍正常組織顏色、質地接近，邊界線模糊，與正常組織融合度較好，軟骨面平整光滑，關節腔內無明顯骨贅形成。

同時，通過對每組各個時間點修復的軟骨組織進行大體評分可知(表1)，D組16周時軟骨修復得分最高，進一步證明同種異體骨軟骨柱包裹Ad-BMP-4-BMSCs修復效果最佳。

表1 軟骨修復大體觀察評分Table 1 General observation score of cartilage repair

2.3 標本切片HE染色

圖3 HE染色Fig.3 HE staining

結果如圖3所示。A組3個時間點無明顯組織生長；B組8周較4周可見新生組織形成，至16周時缺損處長滿新生組織；C組8周缺損處已長滿新生組織，但染色較淺，組織較疏松，16周時染色較深，組織結構較致密，與周圍正常組織邊界清晰，組織中心可見明顯凹陷；D組4周時新生組織較其余3組明顯增加，存明顯差異，8周缺損處已長滿新生組織，其中細胞排列清晰，但邊界依舊明顯，16周時新生組織表面平整，無凹陷，組織層次清晰，細胞排列有序，缺損邊界模糊。

2.4 定量分析再生軟骨組織

圖4 修復組織軟骨染色及定量分析Fig.4 Staining and quantitative analysis of cartilage in repair tissue

結果如圖4所示，A組可見少量膠原纖維填充，16周含量較前2個時間點明顯增加，差異顯著；B組4周時無明顯膠原纖維生成，8周可見膠原纖維形成，16周新生組織基本將缺損填滿，膠原纖維含量較8周無明顯增加，組織層次紊亂，細胞排列不清；C組4周可見膠原纖維生成，8周含量較4周明顯增加，16周可見新生組織中出現淺藍色軟骨細胞，交錯排列，含量較8周明顯增加，存明顯差異；D組4周新生膠原纖維量較前3組有所增長，但無明顯差異，8周缺損長滿，組織層次清晰，16周可見淺藍色軟骨細胞形成，組織層次清晰，缺損邊界模糊，有向周圍正常軟骨分化趨勢，軟骨組織含量與8周差異明顯。同樣，通過對各個時間點修復的軟骨組織進行Wakitani評分(表2)，D組16周時軟骨修復得分最低，進一步證明同種異體骨軟骨柱包裹Ad-BMP-4-BMSCs能夠顯著促進軟骨再生修復。

表2 Wakitani組織學評分Table 2 Wakitani histological score

3 討論

目前，用于軟骨組織工程中的病毒載體主要有逆轉錄病毒載體、慢病毒載體及腺病毒載體。逆轉錄病毒載體針對的靶細胞為增殖期細胞，存在插入突變的風險[12]；慢病毒載體雖然能持續穩定表達目的基因，但存在基因突變、隨機插入的風險；腺病毒載體基因感染效率高，對細胞損害低，靶細胞范圍廣。本研究以腺病毒為載體將BMP-4基因導入BMSCs，并成功在體外感染同種異體骨軟骨柱，為后續動物實驗打下基礎。

骨軟骨移植物主要為同種異體骨軟骨與自體骨軟骨。自體骨軟骨移植易受到供體少及供體繼發病變的限制。同種異體骨軟骨移植物分為新鮮骨軟骨移植與冷凍骨軟骨移植，前者存在以下缺陷：①儲存時間較短；②存在免疫排斥反應；③潛在傳染病傳播風險；④難以確定最佳手術時機。雖然冷凍同種異體骨軟骨在-80 ℃的深度冷凍下高達95%的軟骨細胞會丟失，但可保持細胞外基質結構、延長潛在儲存時間、降低免疫原性并降低傳染病傳播的風險[13]。

本研究借鑒組織工程原理，將經過程序性深低溫處理的同種異體骨軟骨柱作為支架材料，結合種子細胞及生物活性因子，實現了軟骨組織的有效再生。但在實驗過程中依舊發現了一些問題及不足之處：①經過冷凍處理后的同種異體骨軟骨易出現軟骨平臺下降、塌陷及斷裂，可能與冷凍保護劑的選擇及冷凍時間的長短有關；②動物取材時，關節腔內出現積膿，侵蝕軟骨平面，導致軟骨修復欠佳，可能與術中無菌操作，術后抗生素使用時間、劑量及動物飼養環境有關；③未進行納米壓痕儀測試修復軟骨和正常軟骨的硬度、彈性模量、屈服強度等，無法評估修復后的軟骨剛性。

軟骨損傷所致骨關節炎一直是臨床亟需解決的難題，本研究發現BMP-4修飾的BMSCs復合同種異體骨能夠實現軟骨組織的有效再生。希望能夠為臨床修復膝關節軟骨缺損做出貢獻。