禽源沙門氏菌快速檢測方法研究進展*

方煥新 李智麗 黃淑堅 何 誠 袁 生

(1. 佛山科學技術學院生命與生物工程學院，佛山 528231)(2. 中國農業大學動物醫學院，北京 100193)

沙門氏菌病是由沙門氏菌(Salmonella)引起人和各種溫血動物的一種人畜共患病，臨床上分為傷寒、副傷寒、胃腸炎和敗血癥四種主要癥候群。在細菌性食物中毒報告病例中，沙門氏菌毒常列榜首，其中，重要的人獸共患病原菌包括：鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)、乙型副傷寒沙門氏菌(S.para-typhiB)、豬霍亂沙門氏菌(S.choleraesuis)、德爾俾沙門氏菌(S.derby)、海德堡沙門氏菌(S.heidelberg)、嬰兒沙門氏菌(S.infantis)。

沙門氏菌具有血清型多、宿主分布廣泛，臨床上存在難以防治、難以凈化等“卡脖子”技術問題，長期依賴抗菌素治療引發的抗菌素耐藥性和抗菌素殘留，也嚴重威脅著畜禽健康養殖和人類健康。

1 沙門氏菌的診斷方法進展

1.1 細菌培養和鑒定標準

傳統的細菌培養法作為法定的檢測技術手段，需要7 d檢測時間，我國國標采用對所有樣品進行增菌后檢測，與加拿大健康保護分支(Health Protection Branch，HPB)、美國食品藥物管理局細菌學分析手冊(Food & Drug Adimnistration，FDA/Bacteriological Analytical Manua，BAM)、官方分析化學家協會(Association of Official Analytical Chemists，AOAC)、美國農業部食品安全檢驗局(Food Safety and Inspection Service of United States Department of Agriculture，USDA/FSIS)和國際標準化組織(International Organization for Standards，ISO)等國家或國際組織推薦增菌樣品方法一致。國家標準GB 4789.4—2016《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》與美國、加拿大和國際組織的檢測區別點見表1所列。

1.2 沙門氏菌傳統的抗原分型診斷

血清型鑒定依據考夫曼-懷特血清表，結合生化試驗、玻片凝集試驗鑒定多聚糖菌體(O)抗原、莢膜抗原(Vi)和鞭毛(H)抗原[1]，劃分為A～Z 和 O51～O63、O65～O67共 42 個O 群，58 種 O 抗原和63 種 H 抗原[2]。

1.3 玻片凝集法檢測抗體

以雞白痢標準株(O-1、9、123)和變異株(O-1、9、122)制備多價抗原，可以檢測雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌[3]。但大腸桿菌、鏈球菌、微球菌等具有相同抗原，雞白痢假陽性率達到40%[4]。如何減少玻片凝集法存在的缺陷問題，是目前亟待解決的技術難題之一。

表1 沙門氏菌不同檢測方法的區別點Table 1 Detecting assays for Salmonella diagnosis

1.4 免疫膠體金技術檢測抗體

利用原核表達系統獲得invA重組蛋白，純化后作為診斷標記物,將其包被在硝酸纖維素膜，結合膠體金免疫顯示技術， 制備成雞白痢沙門氏菌膠體金免疫層析試紙條。因過高的敏感性而導致的假陽性過高是其不足，需要進一步優化條件[5]。

1.5 磁柱吸附法

磁珠上包被能夠特異性識別沙門氏菌表面蛋白的抗體進行快速、富集沙門氏菌，利用含有沙門氏菌生長的營養成分、選擇劑以及特異酶顯色底物的微生物測試片，對微生物進行雙重篩選，提高沙門氏菌檢測的特異性[6]。24 h內可完成檢測，不需要大型設備，大大降低了檢測成本。該方法缺陷是定性檢測，無法分型檢測。

1.6 ELISA法檢測抗原和抗體

ELISA方法具有快速、特異性和大批量檢測樣品，檢測靈敏度可達1×105～1×106CFU/mL[7]。以腸炎沙門氏菌血清型特異單抗制備ELISA法，與國標法符合率為97.14%[8]。以腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的O抗原建立ELISA檢測抗體法，出現3%～30%的交叉反應[9]。雞白痢脂多糖和保守蛋白作為包被抗原，ELISA法敏感性和特異性高于玻片凝集試驗、瓊脂擴散試驗。焦新安等[10]利用O9抗原的單克隆抗體，建立了抗體競爭ELISA。陳小玲等[11]利用沙門氏菌菌毛保守蛋白fimY, 建立了間接fimY-ELISA方法，其敏感性優于平板凝集試驗，但是特異性低于脂多糖-ELISA。以SpiC蛋白建立間接ELISA，可以區分感染和免疫雞白痢疫苗雞群[12]。

1.7 分子生物學診斷技術進展

沙門氏菌屬特異性基因包括吸附和侵襲上皮細胞表面蛋白基因(invA)、 I 型菌毛基因(fimA)、腸毒素基因(stn)、侵襲調節蛋白基因(hilA)、H1相抗原基因(fliC)、毒性質粒相關毒力基因(spv)、LPS O 抗原rfb基因、組氨酸轉運操縱子基因(hut)、外膜蛋白基因(opmC)、16S rRNA基因和16S-23S rDNA 之間的區域基因，16S-23S rDNA被作為PCR 檢測屬特異引物的靶基因[13-14]。

1.7.1PCR檢測技術：根據國內流行的B、C1、D和E1群，建立基于O和H抗原多重PCR鑒定方法，可以檢測腸炎、鼠傷寒、雞白痢、雞傷寒等589種沙門氏菌血清型[15]。利用InvJ基因設計的多重PCR，對腸炎沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌等7種沙門氏菌種特異性鑒定[16]。

1.7.2疊氮溴化丙錠-脫氧膽酸鈉-微滴數字PCR(SD-PMA-ddPCR)檢測技術： 其原理是樣品進行微滴化處理，經PCR擴增后，有熒光信號的微滴判讀為1，無熒光信號的微滴判讀為0，根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例即可得出靶分子的起始拷貝數或濃度。SD-PMA-ddPCR技術能成功檢測活菌核酸，避免死菌對檢測結果的干擾，這對監測食品污染的活菌具有鑒別診斷用途[17]。

1.7.3交叉引物等溫擴增法：以沙門氏菌腸侵襲蛋白invA基因特異保守序列，設計交叉引物等溫擴增探針序列，檢測低限為 10 CFU/mL。優點是可大量、快速檢測，不能用于分型鑒定[18]。

1.7.4基因芯片技術：設計鞭毛H1、H2和體細胞O抗原寡核苷酸探針，標記生物素制成SalmonellaGenoSerotyping Array(SGSA)微陣列芯片，最低細菌檢測限為860 CFU/mL，可檢測出112種血清型[19-20]。國際上三種商品化的基因芯片檢測盒分別為：Salm Sero-Genotyping As-1 kit[21]，Check & Trace(Check-Points)[22]以及xMAP Salmonella serotyping assay(xMAP)[23]。4種方法的優點和缺點見表2所列。

表2 基因芯片法檢測技術的比較Table 2 Comparison among different gene-chip kits

1.7.5CRISPR-SeroSeq： CRISPR位點是細菌基因組中進化最快的基因元件之一，并且具有包含細菌所特有的生物學的多態性[26]。通過對CRISPR位點的擴增和測序，然后利用CRISPR finder對間隔序列的比對分析，進而完成對單一樣品的不同沙門氏菌血清型檢測可檢測蒙德維的亞、肯塔基、腸炎、鼠傷寒沙門氏菌等菌株。所提及的檢測方法的優缺點比較結果見表3所列。

表3 不同沙門氏桿菌檢測方法優點和缺陷Table 3 Advantages and disadvantages of different assays

目前存在沙門氏菌血清型眾多，單一的診斷方法難以實現快速診斷，以高敏感性和特異性鑒別不同血清型。高通量基因芯片法存在依靠熒光閱讀設備，檢測成本高，無法直接在臨床應用，難以大量推廣的技術困境。CRISPR-SeroSeq有望縮短檢測時間，實現高敏感性和特異性的有機結合，區分不同血清型，尚需要相關深入的研究，建立成熟的技術平臺，開發一系列診斷試劑盒。

2 針對SPF雞群的沙門氏菌檢測方法

SPF雞群作為目前最常用的實驗動物之一，沙門氏菌列為19種必檢項目之一。按照國標GB/T 17999.1—2008推薦3種方法檢測：血清平板凝集試驗、病原分離和試管凝集試驗。針對SPF鼠沙門氏菌檢測，以菌種分類gyrB基因為診斷靶點，優化擴增條件并建庫，利用 Illumina 高通量測序技術對樣本進行測序和序列分析，能夠檢測出樣本中極微量的沙門氏菌，檢測限可達0～100 CFU/mL。該檢測方法具備穩定性好、靈敏度高的特點[27]。選取invA基因作為 LAMP 法檢測靶點基因，設計4～6條引物，檢測限為33.6 CFU/mL，適用于樹鼩糞便樣品的檢測[28]。因此，高通量測序技術、LAMP方法適用于其他實驗動物(如雞、大鼠、豚鼠、兔等)沙門氏菌的檢測。

3 展望

沙門氏菌污染對養殖業、SPF動物、食品安全等方面存在重大威脅，開發更加快速、鑒別診斷試劑盒勢在必行，提高沙門氏菌的檢測效率，保證畜禽養殖和人類健康至關重要。

利用傳統的細菌培養法，并結合生化實驗和玻片凝集實驗來鑒定分型，所消耗的時間往往貽誤了及時發現解決問題的時機，而且面對如此多的血清型，這種鑒定方法往往會出現錯誤診斷。未來沙門氏菌檢測技術必須符合如下條件：①現場檢測，可視化判定，縮短檢測時間；②價格合理，養殖企業可以普遍接受，以達到大面積的技術推廣；③具備區分不同屬特異性和鑒別不同的血清型；④區分不同的致病性和動物宿主來源，實現動物溯源可追蹤性。杜絕沙門氏桿菌從食品動物向消費者侵害，確保食品安全的最后一道防線，保證消費者的健康。

總之，開發敏感、特異性、便捷、快速的新型沙門氏桿菌試劑盒，既可以實現控制國內沙門氏菌向外擴散和人畜共患感染，也可以防止從境外向國內輸入性感染，可以為畜禽養殖提供技術保證，為食品安全和人類健康提供技術支撐。