應用COMT基因SNP位點鑒別拉布拉多和金毛獵犬膽量行為的研究

白 靜 馬雪娜 陳舒婷 雒 東 周子娟 王靖宇 王福金

(大連醫科大學實驗動物中心，大連 116044)

工作犬如導盲犬、警犬、軍犬、搜索犬、偵緝犬等經過嚴格篩選和專業培訓，一直活躍在國家各個職能部門協助社會工作，不可替代。在工作犬的培訓過程中，高效的篩選方法對縮短培訓時間、提高培訓成功率有很好的輔助作用。

膽量在導盲犬、警犬等多種工作犬的篩選中都是十分重要的篩選指標[1]。由于膽小性情阻礙了犬與人類的正常交流，給人類使用導盲犬添加諸多障礙，因而成為導致導盲犬在培訓過程中被淘汰的主要因素之一[2-5]。警犬的工作內容往往具有一些挑戰性，需要犬有良好的環境適應能力、抗壓能力等，因而膽量是警犬基本的警用素質。膽小性情具有顯著的遺傳特性[6]，因此，應用行為遺傳學方法鑒別膽小性情的犬具有重要的理論價值和實際意義。

兒茶酚-O-甲基轉移酶(catechol-O-methyltransferase，COMT)位于細胞質內，廣泛存在神經和非神經組織內。特別是，COMT還存在于神經膠質和突觸后膜上，在單胺類神經遞質的代謝中發揮重要作用，如多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素，并通過調節多巴胺的表達，影響人類的認知和大腦額葉功能[7]。已有研究表明，COMT與人類的認知、記憶、個性、焦慮行為，甚至精神疾病都有密切關系，也是相應治療藥物的作用靶標[8]。特別是許多研究已經顯示人類COMT基因的幾個SNP位點與人類恐懼和焦慮行為有顯著的相關性，可作為膽量、焦慮及精神分裂癥等相關行為鑒別的重要候選基因[9-10]。但是，目前并沒有研究表明COMT基因SNP位點與犬的膽量行為具有相關性。因此，本研究通過qPCR-HRM方法檢測犬COMT基因SNP位點的多態性，并分析其基因型及單倍型與犬膽量行為的相關性，旨在為工作犬的培訓建立分子遺傳標記。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1研究對象：選取中國導盲犬大連培訓基地的118只犬作為研究對象：拉布拉多，91只，53雄38雌；金毛獵犬，27只，16雄11雌。犬的年齡均為12～24月齡。為了保證實驗數據的準確性，選取的118只犬均具有明確的遺傳背景并且處于相似的生活環境。

1.1.2主要試劑與儀器：血液DNA提取試劑盒(TaKaRa Code：D9081)； LightCycler? 480 High Resolution Melting Master 試劑盒(Roche)； PCR儀(Thermo)；電泳儀(百晶生物技術有限公司)；Gel DocTM EZ成像儀(Bio-Rad)；熒光定量PCR儀(LightCycler? 96 System，Roche)等。

1.2 方法

1.2.1DCA測試方法：犬膽量評估(dog courage assessment，DCA)是基于Svartberg等[11]所描述的 DMA 測試中的4個子測試(12個行為變量)評估犬膽量行為的方法：突然出現(恐懼、好奇、持續恐懼、持續興趣)、金屬響聲(恐懼、好奇、持續恐懼、持續興趣)、扮鬼(恐懼、好奇、接觸)、槍聲。主要對犬的驚嚇反應進行觀察，并依據標準化評分表[12]對犬的12個行為變量的反應強度進行評估，劃分1～5個強度等級。通過構建的標準化評分表對子測試中行為變量的膽量強度得分進行等權相加，低分值對應低膽量強度，高分值對應高膽量強度。

1.2.2COMT基因SNP位點的選取：本文主要選取COMT的4個SNP位點(-1 666 bp C>G、c.39 A>G、c.216 G>A和c.482 G>A)進行基因型鑒定。-1 666 bp C>G位于COMT基因的上游調控區域，可能對基因的表達水平具有潛在影響；其余的3個SNP位點位于COMT基因的外顯子區域，其中c.482 G>A為錯義突變位點，可能對COMT基因的蛋白質結構功能產生影響；c.39 A>G和c.216 G>A為同義突變。

1.2.3HRM法鑒定基因型：高分辨率熔解曲線法(high resolution melting，HRM)是通過qPCR擴增過程中的熔解曲線的變化情況檢測靶標基因序列變異的方法[13-14]。HRM具有高靈敏度，高通量，快速，低檢測成本的優點[15-16]。以測序結果作為對照，我們對qPCR-HRM反應中的DNA模板量、引物退火溫度、Mg2+濃度等條件進行了優化，使其達到對COMT基因的4個SNP位點多態性的最佳檢測效果。具體優化條件為(20 μL反應體系)：模板DNA量(基因組DNA)為36 ng、Mg2+終濃度為2.5 mmol/L或3.0 mmol/L、引物濃度(PCR終濃度)為0.2 μmol/L。檢測位點的引物及最優退火溫度見表1所列。

表1 COMT基因SNP位點的引物序列及退火溫度Table 1 Primer sequences and annealing temperature of the SNPs of COMT gene

1.3 統計方法

使用SPSS 19.0 分析品種、性別和年齡因素與膽量行為之間的相關性，多重比較分析SNP位點的基因型與膽量行為之間的相關性；使用PHASE 2.1軟件對單倍型進行相關性分析；使用BioEdit v7.2.5軟件分析每個位點的基因，使用LightCycler? 96 SW 1.1 software軟件HRM檢測法分析差異圖和歸一化熔融峰；使用GraphPad Prism 5軟件中的雙向ANOVA和Bonferroni事后檢驗進行整體分析。

2 結果

2.1 膽量行為與品種、性別及年齡間的關聯性分析

結果顯示(表2)，拉布拉多和金毛獵犬的品種、性別、年齡與膽量行為沒有顯著相關性(P>0.05)。

表2 膽量行為與品種、性別及年齡間的關聯性分析Table 2 Correlation analysis between potential factors and scores of startled behavior

2.2 COMT基因SNP位點的基因型和基因頻率檢測

采用HRM法檢測犬SNP位點基因型和基因頻率，結果顯示(表3)：①-1 666 bp C>G位點的基因型為CC、GG和CG，其中CC型的頻率最高(87.3%)，C等位基因為優勢等位基因(92.8%)；②c.216 G>A和c.482 G>A位點的基因型為GG、GA和AA，其中GG型的頻率最高(70.3%和77.1%)，G等位基因為優勢等位基因(83.9%和87.3%)；③c.39 A>G位點的基因型為GG、GA和AA，其中GG型的頻率最高(42.4%)，A和G等位基因的頻率相同(50%)。

表3 COMT基因SNP位點的等位基因頻率及基因型頻率Table 3 Allele frequency and genotype frequency of the four SNPs of COMT gene

2.3 膽量行為與COMT的SNP基因型的關聯性分析

結果顯示(表4)，4個SNP位點的基因型與膽量行為顯著相關(P<0.01)。-1 666 bp C>G位點CC 與CG基因型之間與膽量行為的關聯性存在顯著差異(P<0.01)，而CC與GG基因型之間僅在扮鬼和槍聲測試中與膽小行為存在顯著差異(P<0.01)。c.39 A>G、c.216 G>A和c.482 G>A位點的主要等位基因純合子GG型和其他基因型(GA和AA型)之間與膽量行為的關聯性存在顯著差異(P<0.01)。

表4 COMT的SNP基因型與犬膽量行為的關聯性分析Table 4 The correlation analysis between SNP genotypes of COMT gene and scores of startled behavior of dogs

2.4 膽量行為和COMT的SNP單倍型的相關性分析

初步分析結果表明(圖1)：犬COMT的SNP單倍型頻率在4個子測試驚嚇行為變量中的分布相一致。進一步采用GraphPad Prism 5軟件中的雙向ANOVA和Bonferroni事后檢驗進行整體分析的結果顯示(圖2)，CGAG(1121)(P<0.001)，CGGA(1112)(P<0.01)，CGAA(1122)(P<0.001)和 GGAA(2122)(P<0.001)是膽小犬的特征單倍型系統；CGGG(1111)(P<0.001)和CAGG(1211)(P<0.001)是非膽小犬的特征單倍型系統。其中，COMT基因的c.216 G>A和c.482 G>A位點的A等位基因在犬的膽怯行為上起主導作用。

圖1 COMT的SNP單倍型頻率在4個子測試驚嚇行為變量中的分布注：**P<0.01，***P<0.001 Fig.1 Frequency of haplotype distributionin 4 sub-test startle behavior variablesNote: **P<0.01,***P<0.001

圖2 COMT的SNP單倍型與驚嚇行為變量的關聯性分析注：**P<0.01，***P<0.001 Fig.2 Associations between startled behaviors of dogsand the haplotypes of the SNPs of COMT geneNote: **P<0.01,***P<0.001

3 討論

雖然有研究表明，犬的COMT基因的SNP位點存在多態性并且可能與犬的行為相關[17]，但COMT基因SNP位點與犬膽小性情之間的相關性研究鮮有報道。本研究結果表明，COMT基因SNP位點的多態性與犬的膽小性情間存在顯著相關性。COMT基因的3個SNP位點：-1 666 bp C>G、c.216 G>A和c.482 G>A的主要等位基因純合子與高DCA評分(勇敢行為)密切相關，而雜合子或次要等位基因的純合子與低DCA評分(膽小行為)相關。基因型頻率分析也顯示，主要等位基因的純合子個體構成了測試犬的絕大多數，這意味著雜合子個體或具有次要等位基因的純合子個體面臨更強的選擇壓力。單倍型分析顯示，CGAG、CGGA、CGAA和GGAA代表了膽小犬的特征單倍型系統。特別是c.216 G>A和c.482 G>A位點的A等位基因在犬的膽小行為中起主導作用。

已有大量文獻表明，人類Val158Met(c.472 G>A)基因型與情感喚醒和情緒調節有關。特別是Met(A)等位基因與焦慮癥相關，而Val(G)等位基因與積極的情緒密切相關[18-19]。我們的研究結果顯示，c.482 G>A位點的Arg(G)等位基因與犬的高DCA分數(勇敢行為)密切相關，而Gln(A)等位基因與犬的低DCA分數(膽小行為)顯著相關。有報道顯示，人類和犬的COMT基因具有高度同源性(84%)，并推測人的Val158Met(c.472 G>A)與犬的c.482 G>A SNP位點可能具有相似功能[17]。這可能是因為人的Val158Met(c.472 G>A)與犬的c.482 G>A SNP位點位于相同功能區，并且都是錯義突變位點，引起氨基酸的改變，從而影響COMT蛋白的功能，進而影響人類和犬的行為性狀的表現。

另外，Lee等[20]研究發現，COMT基因的Ala72Ser(c.214 G>A)與人類的精神病和攻擊行為有關，Ser等位基因是精神分裂癥的危險基因。而犬的COMT基因的c.216 G>A位點的堿基恰好編碼的是犬的72號位的蛋白。雖然犬的c.216 G>A是同義突變，但其與犬膽小性情具有顯著相關性，表明該位點的多態性與COMT基因的功能密切相關。由于人類COMT基因具有多種功能，COMT可能不僅影響膽小性情，還會影響其他性情甚至精神障礙，因而，進一步闡明COMT在犬中的功能將為人類疾病的研究提供有價值的動物模型。

本研究主要以拉布拉多和金毛獵犬作為研究對象，并且樣本量有限。為進一步確實COMT基因SNP位點的多態性與膽小性情的顯著相關性，后期的研究應進一步擴大樣本量，增加犬的品種。另外，還應考慮到各種神經遞質相關基因之間的交互作用，以及基因與環境的交互作用，采用多基因及基因-環境設計的研究方法，從多方面多角度進行分析，探究COMT在神經系統中的重要作用，進一步為工作犬、寵物犬以及人類疾病的研究提供有價值的參考和啟示。

特別值得注意的是，人為的遺傳育種會導致許多先天性疾病，如心臟病、失明和耳聾等[21]，導致犬種質量的降低。雖然本研究結果顯示了COMT基因SNP位點的多態性與拉布拉多和金毛獵犬膽小性情的顯著相關性，可以作為鑒別膽小性情犬的理想遺傳標記，但不應用于遺傳育種，以免產生犬種品質下降的不良后果。再者，從進化角度來看，膽小作為一種警告信號，可以使機體免于危及生命或健康的危險行為，是進化的一種必然產物[3]。

綜上所述，COMT基因的SNP位點與拉布拉多和金毛獵犬的膽小行為間存在顯著相關性，揭示了COMT基因對犬的膽小性情具有重要影響，可作為早期鑒別犬膽小性情的有效的遺傳分子標記，為降低工作犬的培訓成本，提高培訓成功率提供了一個有效的途徑。