HEV經(jīng)輸血感染兔模型研究*

梁春南 劉志國(guó) 黃維金 趙晨燕 邢 進(jìn) 付 瑞 王佑春 佘銳萍

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)(2.中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 102629)(3.中國(guó)食品藥品檢定研究院，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法與標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局生物制品質(zhì)量研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102629)

戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)是目前引起人類急性病毒性肝炎的重要病原體之一，為人畜共患病毒[1]。經(jīng)估算，每年全球約有2 000萬(wàn)人感染HEV，相關(guān)死亡人數(shù)約7萬(wàn)，孕婦感染HEV后病死率可達(dá)20%[2]。傳統(tǒng)上認(rèn)為其主要經(jīng)糞-口途徑傳播，HEV感染后造成的戊型肝炎主要表現(xiàn)為急性自限性疾病[1]。而近十年研究者們發(fā)現(xiàn)，HEV感染免疫抑制患者可造成慢性化并引起纖維化甚至肝硬化等嚴(yán)重疾病表現(xiàn)，危及生命[3-5]。同時(shí)，多項(xiàng)近期研究報(bào)道HEV感染后還可引發(fā)多種肝外疾病，包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腎臟疾病和血液系統(tǒng)疾病等[6-7]。這些新的臨床表現(xiàn)，引起了全球廣泛關(guān)注。

隨著研究不斷深入，HEV除糞-口途徑之外的其他傳播途徑也被研究者發(fā)現(xiàn)。日本學(xué)者M(jìn)atsubayashi等[8]首先報(bào)道了HEV經(jīng)輸血傳播的臨床案例報(bào)告，此后英國(guó)于2006年[9]、美國(guó)于2019年也有疑似案例報(bào)道[10]。目前，已有多國(guó)報(bào)道在當(dāng)?shù)匮破分袡z測(cè)到HEV RNA[11]，我國(guó)近年來(lái)也有檢出[12-17]。在英國(guó)開展的一項(xiàng)調(diào)查當(dāng)?shù)?25 000份合格的獻(xiàn)血樣品研究中，發(fā)現(xiàn)其中79份為HEV RNA陽(yáng)性(1∶2 878)，基因型均為HEV基因3型(HEV-3)。后續(xù)跟蹤未被召回的血制品發(fā)現(xiàn)，有43位患者接受了污染血制品輸血，其中18位發(fā)生HEV感染(41.9%)。該研究引起廣泛關(guān)注[18]，目前歐洲多國(guó)已將血制品HEV RNA篩查納入常規(guī)篩查項(xiàng)目，以加強(qiáng)輸血安全[11]。

臨床上關(guān)于HEV經(jīng)輸血傳播案例逐漸增多，但目前仍缺乏有關(guān)其感染建立和感染動(dòng)態(tài)的基礎(chǔ)研究和動(dòng)物模型。因此，需要使用理想的動(dòng)物模型模擬輸血傳播過(guò)程。實(shí)驗(yàn)兔是目前用于HEV感染研究的較理想的小動(dòng)物模型之一[19]，其體型適中，可以通過(guò)接收足夠體積的血類樣品，滿足感染建立對(duì)HEV總病毒載量的需求。實(shí)驗(yàn)兔雖然有血清分型，但同種輸血無(wú)需進(jìn)行血型配對(duì)[20]。相比非人靈長(zhǎng)類和豬等HEV感染常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，兔在經(jīng)濟(jì)和倫理上也更容易被接受和利用。本研究使用HEV感染實(shí)驗(yàn)兔作為輸血供體，采集供體抗凝血模擬輸血給受體兔，開展經(jīng)輸血感染的兔模型的研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1HEV病毒：兔HEV，為中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)室從兔體中自行分離的GDC9株，GenBank登錄號(hào)為：FJ906895，研究開始前經(jīng)SPF兔傳代復(fù)蘇，感染兔糞便加入到含2%BSA的生理鹽水中，制成30%的糞便懸液，抽樣檢測(cè)病毒滴度，分裝后凍存在-80 ℃冰箱中。

1.1.2實(shí)驗(yàn)兔：SPF級(jí)，由中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK (京)2017-0005，經(jīng)檢測(cè)排除HEV感染和免疫史，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)： SYXK(京)2017-0013，本研究通過(guò)中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)的審查。

1.1.3儀器與耗材：QIAcube? HT 高通量核酸提取儀及配套的cador? Pathogen 96 QIAcube? HT Kit(5)和QIAcube?HT Plasticware組合套裝；ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀；戊型肝炎病毒RNA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京金豪制藥有限公司；戊型肝炎病毒抗原檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)、戊型肝炎病毒抗體(HEV-Ab)酶聯(lián)免疫法診斷試劑盒(雙抗原夾心法)，購(gòu)自北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1供體兔培育：4只SPF級(jí)離乳兔(約45日齡)，分別編號(hào)為D01～04。檢疫適應(yīng)期1周，檢測(cè)排除HEV感染和免疫史后，經(jīng)耳緣靜脈注射接種兔HEV，病毒來(lái)源于兔糞便懸液，接種次數(shù)為1～2次，4只兔接受攻毒總劑量比例約為1∶1∶1∶2(D01∶D02∶D03∶D04)。每周收集糞便和耳緣靜脈血，檢測(cè)抗原、抗體和核酸等感染指標(biāo)，以追蹤供體兔的感染動(dòng)態(tài)，選擇抗原和核酸陽(yáng)性的兔采集靜脈血。

1.2.2受體兔準(zhǔn)備：根據(jù)供體兔培育方案，在輸血樣本采集日前1周，按2倍受體兔的數(shù)量購(gòu)入SPF離乳兔，檢疫適應(yīng)期1周，檢測(cè)排除HEV感染和免疫史后，研究實(shí)際采用受體兔5只(編號(hào)分別為R01～05)，均于輸血當(dāng)天稱體質(zhì)量。

1.2.3輸血樣本采集：根據(jù)供體兔培育方案，在設(shè)定日期，在采用舒泰與塞拉嗪復(fù)合全身麻醉后，以肝素鈉真空采血管自供體兔后腔靜脈竇(膈與肝靜脈匯入口之間，后腔靜脈膨大部)采集抗凝血，每只供體兔預(yù)留1.5 mL抗凝血以檢測(cè)輸血樣本中HEV核酸載量外，其余部分用于后續(xù)輸血。

1.2.4輸血及輸血后監(jiān)測(cè)指標(biāo)：按1.2.3采集的輸血樣本，根據(jù)受體兔體質(zhì)量，于采集后立即以約10 mL/kg經(jīng)耳緣靜脈推注給予輸血受體兔，輸血后觀察30 min確定受體兔無(wú)異常。輸血當(dāng)日、輸血后連續(xù)13周，每周收集受體兔糞便和耳緣靜脈血以監(jiān)測(cè)受體兔糞便HEV抗原、核酸，血清抗體，以評(píng)估抗體對(duì)輸血感染SPF兔成模率、持續(xù)排毒時(shí)間長(zhǎng)短等。操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)結(jié)果計(jì)算樣品吸光度值與臨界值的比值(S/CO)。輸血方案及監(jiān)測(cè)指標(biāo)詳見(jiàn)表1所列。

表1 輸血方案及監(jiān)測(cè)指標(biāo)Table 1 Blood transfusion study design

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究采用EXCEL和GraphPad處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和圖表。

2 結(jié)果

2.1 供體兔和輸血樣本

4只供體兔接種HEV的情況見(jiàn)表2所列，接種HEV后的感染動(dòng)態(tài)指標(biāo)監(jiān)測(cè)結(jié)果如圖1～圖4所示。4只兔的糞便和血液核酸均為陽(yáng)性的當(dāng)天采集靜脈血，采集血液立即用于后續(xù)輸血研究。其中，D01～03兔為同時(shí)耳緣靜脈供給糞便HEV，采集3或5 周在急性感染階段的血液，D04為一只慢性戊肝家兔，采集攻毒后26周的血液。

表2 供體兔培育方案Table 2 Profiles of the donor rabbits

圖2 2號(hào)供體兔接種HEV后感染指標(biāo)動(dòng)態(tài)Fig.2 Dynamic of HEV markers in rabbit of No. D02

圖3 3號(hào)供體兔接種HEV后感染指標(biāo)動(dòng)態(tài)Fig.3 Dynamic of HEV markers in rabbit of No. D03

圖4 4號(hào)供體兔接種HEV后感染指標(biāo)動(dòng)態(tài)Fig.4 Dynamic of HEV markers in rabbit of No. D04

2.2 受體兔體質(zhì)量及輸血量結(jié)果

受體動(dòng)物輸血時(shí)周齡、體質(zhì)量、輸血量和輸血次數(shù)信息見(jiàn)表3所列，R01-05號(hào)兔實(shí)際接受的輸血?jiǎng)┝糠謩e為9.5、10.7、11.7、12.6、10.2 mL/kg，每只受體兔實(shí)際接受輸注HEV核酸拷貝數(shù)為5.19×106、1.19×104、1.26×104、5.00×105、2.21×106。

表3 受體動(dòng)物輸血時(shí)周齡、體質(zhì)量、輸血量和輸血次數(shù)信息表Table 3 Profiles of the recipient rabbits

2.3 輸血后HEV感染指標(biāo)13周動(dòng)態(tài)結(jié)果

靜脈輸血后，5只兔(圖5～圖9)均出現(xiàn)糞便排毒，輸血感染HEV實(shí)驗(yàn)的成功率為5/5(100%)。其中2/5(R02和R03)兔排毒時(shí)間均小于6周，為急性HEV感染，僅有糞便排毒，血液中核酸和抗原檢測(cè)均為陰性，但是血液抗體均為陽(yáng)性，且抗體滴度S/CO只均大于13，屬于強(qiáng)陽(yáng)性，在4～7周便開始陽(yáng)轉(zhuǎn)。3/5(R01、R04和R05)兔排毒時(shí)間超過(guò)3個(gè)月以上，在13周的觀察期末糞便核酸仍為陽(yáng)性，為慢性HEV感染，除了糞便排毒外，同時(shí)有病毒血癥和血液HEV抗原陽(yáng)轉(zhuǎn)，3只慢性感染的兔R01未發(fā)生抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)，R04兔第8～10周抗體呈現(xiàn)弱陽(yáng)性外，其他監(jiān)測(cè)時(shí)段均呈陰性；R05兔的抗體在輸血后第12 周才出現(xiàn)明顯的陽(yáng)轉(zhuǎn)。

圖5 1號(hào)受體兔輸血后13周HEV感染指標(biāo)動(dòng)態(tài)Fig.5 Dynamic of HEV markers in recipient rabbits No.R01

圖6 2號(hào)受體兔輸血后13周HEV感染指標(biāo)動(dòng)態(tài)Fig.6 Dynamic of HEV markers in recipient rabbits No.R02

圖7 3號(hào)受體兔輸血后13周HEV感染指標(biāo)動(dòng)態(tài)Fig.7 Dynamic of HEV markers in recipient rabbits No.R03

圖8 4號(hào)受體兔輸血后13周HEV感染指標(biāo)動(dòng)態(tài)Fig.8 Dynamic of HEV markers in recipient rabbits No.R04

圖9 5號(hào)受體兔輸血后13周HEV感染指標(biāo)動(dòng)態(tài)Fig.9 Dynamic of HEV markers in recipient rabbits No.R05

3 討論

自2002年日本報(bào)道首例輸血傳播HEV的臨床病例[8]后，多國(guó)在當(dāng)?shù)孬I(xiàn)血員樣品中檢測(cè)到HEV RNA，且經(jīng)輸血傳播HEV的案例報(bào)道不斷增多，HEV的輸血傳播風(fēng)險(xiǎn)也越來(lái)越重視[12]。但臨床研究的主要關(guān)注點(diǎn)在于血液樣本的HEV血清學(xué)篩查，以及在發(fā)生疑似輸血感染后的溯源調(diào)查。有報(bào)道表明戊型肝炎病毒可能存在有膜結(jié)構(gòu)和無(wú)膜結(jié)構(gòu)兩種形態(tài)，并通常認(rèn)為經(jīng)肝臟進(jìn)入血液的病毒為有膜狀態(tài)，經(jīng)肝臟進(jìn)入膽汁后、通過(guò)糞便排出的病毒為無(wú)膜病毒[1,21-24]。因此，與HEV糞-口傳播途徑相比，HEV經(jīng)輸血傳播后的感染性、致病性和疾病轉(zhuǎn)歸亟需詳細(xì)研究。

早期有研究使用非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物進(jìn)行HEV輸血傳播，將一份來(lái)自于志愿獻(xiàn)血員的10 mL HEV病毒血癥的血漿輸入1只恒河猴，發(fā)現(xiàn)該恒河猴出現(xiàn)了ALT急性升高、抗體升高和病理陽(yáng)性，以及第5～8周糞便排毒、第7周檢出病毒血癥等較典型的急性肝炎表現(xiàn)，HEV RNA克隆片段測(cè)序顯示與輸入血漿攜帶一致，從而直接證實(shí)了HEV經(jīng)血液傳播并導(dǎo)致急性戊肝的可能性[25]。本研究使用5只SPF兔作為輸血受體模型進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)HEV經(jīng)靜脈輸注全血方式成功在兔中除可獲得急性HEV感染外，也可能獲得慢性HEV感染(相關(guān)影響因素在后文另有討論)，為今后研究相關(guān)問(wèn)題提供了新的模型和工具。

對(duì)比供體兔接種HEV核酸拷貝數(shù)與收集血液樣本中HEV核酸拷貝數(shù)發(fā)現(xiàn)，兩者之間未見(jiàn)明顯相關(guān)性：在同樣接種劑量、相同感染周期的情況，D03與D02兩者收集的相同體積輸血樣品中HEV RNA載量倍數(shù)關(guān)系超過(guò)35倍；D01接種劑量約為D04的1/2，其收集的相同體積輸血樣品中HEV RNA載量約為后者2.85倍；這可能是感染劑量、感染周期、以及個(gè)體差異等綜合因素共同決定。

血清中的HEV核酸載量常低至實(shí)驗(yàn)室手段無(wú)法檢出而被界定為陰性，實(shí)驗(yàn)兔可以通過(guò)接收足夠體積的血液樣品而滿足感染發(fā)生對(duì)HEV總載量的需求。本研究收集用于輸血的全血樣本中，采自D02的輸血樣本病毒核酸滴度低至7.43×102拷貝數(shù)/mL, 按實(shí)際輸血體積10.7 mL/kg和11.7 mL/kg分別輸注給R02和R03 2只受體兔，每只兔實(shí)際接受輸注HEV核酸載量達(dá)到1.19×104和1.26×104個(gè)拷貝而實(shí)現(xiàn)了急性感染，另外3只受體兔，實(shí)際接受輸注HEV核酸載量分別為5.19×106、5.00×105、2.21×106個(gè)拷貝，則呈現(xiàn)出慢性感染。該結(jié)果表明，輸血導(dǎo)致的急性或者慢性感染，可能與受體兔接受輸注的HEV核酸總拷貝數(shù)相關(guān)，高滴度的病毒可能更容易引起慢性感染。本研究中R02和R03 2只兔感染后出現(xiàn)高滴度的HEV抗體，抗體升高后糞便排毒消失，從而引起急性感染。而引起慢性感染的兔，抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)不早于7周，而且抗體滴度低，所以，兔的自身免疫狀態(tài)可能也是引起兔慢性戊肝的原因。

綜上所述，本研究成功建立HEV經(jīng)輸血感染兔模型，感染成功率100%；同時(shí)研究還提供了輸血感染兔詳細(xì)的感染指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化。兔模型可用于有關(guān)HEV輸血傳播的相關(guān)研究，特別是可在未來(lái)探索成功建立感染的最小病毒載量。最后，有關(guān)機(jī)構(gòu)和臨床應(yīng)重視血液制品安全，對(duì)HEV進(jìn)行篩查排除，確保用血安全。