自發(fā)性先天性白內(nèi)障大鼠皮膚移植及生化位點(diǎn)的研究*

尤金煒 董 敏 吳正林 梁 磊 田小蕓

(東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)療保障中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，南京 210002)

本單位于2007年在屏障環(huán)境SD大鼠生產(chǎn)的仔鼠中發(fā)現(xiàn)5只先天性白內(nèi)障大鼠，3只雄性，2只雌性。以此大鼠為基代，培育近交系大鼠，經(jīng)過(guò)10多年的連續(xù)近交繁殖，現(xiàn)已培育至第31代，暫定名為TSC大鼠，理論上已經(jīng)達(dá)到基因高度純合，符合近交系動(dòng)物的近親繁殖代數(shù)要求。我們已經(jīng)對(duì)TSC大鼠各生理指標(biāo)做了相應(yīng)的檢測(cè)與分析，包括：晶狀體的病理學(xué)研究、繁殖性能及生長(zhǎng)發(fā)育試驗(yàn)、生化及血流變學(xué)指標(biāo)、臟器質(zhì)量及系數(shù)以及血壓與體溫基礎(chǔ)數(shù)據(jù)分析[1-6]，為了觀察 TSC大鼠的基因純合度和遺傳穩(wěn)定性，根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[7]我們對(duì)其進(jìn)行了背-背皮膚移植實(shí)驗(yàn)以及酯酶-1、酯酶-3等11個(gè)生化標(biāo)記基因的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

皮膚移植實(shí)驗(yàn)：TSC大鼠10只，6～8周齡，體質(zhì)量170～200 g，雄性。

生化標(biāo)記位點(diǎn)檢測(cè)：TSC大鼠6只，6～8周齡，體質(zhì)量200～220 g，雌雄各半，選自基礎(chǔ)群F29代的同一窩群。

所有動(dòng)物均由本實(shí)驗(yàn)室提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(軍)2017-0018，動(dòng)物均在SPF級(jí)設(shè)施飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(軍)2017-0037，并按使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。其他對(duì)照品系購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。

1.2 主要儀器與試劑

儀器：電泳儀為Bio-Rad Model 3000Xi，醋酸纖維膜和醋酸纖維板為浙江臺(tái)州生產(chǎn)；手術(shù)器材一套。

試劑：Tris(Sigma)、HCl(上海久憶化學(xué)試劑有限公司)等均為國(guó)產(chǎn)分析純；0.9%生理鹽水(浙江濟(jì)民制藥股份有限公司)；青霉素G鈉粉80萬(wàn)單位(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)；0.7%戊巴比妥鈉溶液(南京安培化工科技有限公司)；5%聚維酮碘溶液(東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院)。

1.3 方法

1.3.1皮膚移植實(shí)驗(yàn)：0.7%戊巴比妥鈉溶液按1 mL/200 g腹腔注射麻醉大鼠，大鼠背部朝上固定，背部左右各剃毛一塊，左側(cè)用于自體皮膚移植，右側(cè)用于異體皮膚移植；5%聚維酮碘溶液消毒，取皮約8～10 mm，放入裝有生理鹽水的平皿中，除去真皮以外的筋膜和脂肪等，第1只鼠先行自體皮膚移植，后取右側(cè)用于異體移植，移植順序按1號(hào)鼠移植給2號(hào)鼠，2號(hào)鼠移植給3號(hào)鼠，以此類推，10號(hào)鼠移植給1號(hào)鼠，每片皮片均逆毛移植。用結(jié)節(jié)縫合法將皮片縫合4針，5%聚維酮碘溶液消毒，10%青霉素鈉溶液抗菌，貼上創(chuàng)可貼后壓上消毒紗布并固定，見(jiàn)圖1～圖3，術(shù)后單籠飼養(yǎng)并記錄。

圖1 白內(nèi)障大鼠的異體皮片縫合Fig.1 Suture of allogenric skin graft in cataract rats

圖2 創(chuàng)可貼貼于白內(nèi)障大鼠的手術(shù)創(chuàng)面Fig.2 A band-aid applied to the surgicalwound of cataract rats

圖3 紗布貼壓于白內(nèi)障大鼠移植皮片上Fig.3 Gauze was applied to the skin graft of cataract rats

1.3.2生化標(biāo)記位點(diǎn)檢測(cè)：制備血漿及溶血素，以抗凝毛細(xì)管行眼眶采血術(shù)，500×g、5 min，分離血漿和血球，吸出血漿備用。在去除血漿的富含紅血球的試管內(nèi)加入4份蒸餾水，振蕩1 min，成為紅色透明液體即為溶血素。

組織勻漿上清液：采用安死術(shù)處死動(dòng)物，剖腹，取腎臟1個(gè)，小腸6～8 cm，睪丸1個(gè)，肺臟1葉。分別加入2份適量預(yù)冷蒸餾水，組織勻漿器勻漿。勻漿液置4 ℃低溫高速離心機(jī)中，2 000×g、30 min，吸取上清液備用。

電泳樣品的制備、電泳步驟、染色等都按GB/T 14927.1—2008實(shí)驗(yàn)動(dòng)物近交系小、大鼠生化標(biāo)記檢測(cè)法的規(guī)定進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 皮膚移植實(shí)驗(yàn)

1周后拆除包扎，觀察皮片成活情況，若發(fā)現(xiàn)皮片干癟、脫落則為手術(shù)失敗。如皮片脫痂，手術(shù)部位平整、且10 d后長(zhǎng)出新毛視為手術(shù)成功。本次實(shí)驗(yàn)的10只皮膚移植大鼠均移植成活，見(jiàn)圖4～圖5。

圖4 白內(nèi)障大鼠100 d后自體移植皮片生長(zhǎng)情況Fig.4 Growth of autologous skin graft incataract rats after 100 days

圖5 白內(nèi)障大鼠100 d后異體移植皮片的生長(zhǎng)情況Fig.5 Growth of allografts skin graft incataract rats after 100 days

2.2 生化標(biāo)記位點(diǎn)檢測(cè)

按照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/14923—2010 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量控制、GB/T 14927.1—2008實(shí)驗(yàn)動(dòng)物近交系小、大鼠生化標(biāo)記檢測(cè)法測(cè)定，TSC大鼠的11個(gè)生化標(biāo)記基因呈單一型的純合子，未見(jiàn)到雜合子，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1所列。中國(guó)食品藥品檢定研究院報(bào)告編號(hào)：DH201906614R。

表1 TSC大鼠生化標(biāo)記基因檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection results of biochemicalmarker genes in TSC rats

3 討論

近交系動(dòng)物是指同胞兄妹連續(xù)交配20代以上而培育出來(lái)的遺傳上具有高度純合性和穩(wěn)定性的純品系動(dòng)物[7]。近交系動(dòng)物基因高度純合與一致、實(shí)驗(yàn)結(jié)果精確度高且極易重復(fù)，具有可比性，對(duì)各種應(yīng)激反應(yīng)均一，遺傳背景明確，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究各個(gè)方面。大鼠是比較常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，尤其在生理學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)和腫瘤學(xué)等研究領(lǐng)域。相比近交系小鼠的培育，近交系大鼠培育需要的費(fèi)用較高，且時(shí)間也比較長(zhǎng)，目前國(guó)內(nèi)培育近交系大鼠的較少，已知的近交系大鼠有200多種，常用的大約有150多種[8]。

本單位于2007年以5只先天性白內(nèi)障大鼠為基代，培育近交系大鼠，經(jīng)過(guò)10多年的連續(xù)近交繁殖，現(xiàn)已培育至第31代，暫定名為TSC，該大鼠繁殖力正常，晶狀體外觀以及組織形態(tài)學(xué)改變均符合白內(nèi)障病理改變。人類先天性白內(nèi)障的病因比較復(fù)雜，病理機(jī)制不完全清楚，且能夠跟蹤研究的樣本較少，此模型大鼠有可能在研究人類發(fā)病機(jī)制、尋找藥物靶點(diǎn)等醫(yī)學(xué)研究方面成為一種有價(jià)值的動(dòng)物模型。大量的研究結(jié)果已經(jīng)證明，近交系動(dòng)物基因高度純合，免疫源性高度一致，其同種(系)異體皮膚移植不會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)；皮膚移植是近交系動(dòng)物遺傳監(jiān)測(cè)的指標(biāo)之一。皮膚移植有背-背法移植，尾-尾法移植，耳-背法和尾-背法等方法。本文采用背-背法全厚皮片對(duì)自行培育的先天性白內(nèi)障近交系大鼠進(jìn)行自體和異體皮膚移植實(shí)驗(yàn)，以觀察皮片的成活情況。同種(系)異體皮膚移植實(shí)驗(yàn)是利用免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別“自己”與“異體”的特性來(lái)鑒定組織相容性基因是否一致的重要手段[9-11]，同種(系)異體移植成功說(shuō)明同種(系)異體的組織相容性一致。本實(shí)驗(yàn)采用的白內(nèi)障大鼠自體和異體皮膚移植均成活100 d及以上，未發(fā)生排拆反應(yīng)，說(shuō)明自我培育的白內(nèi)障大鼠的組織相容性是一致的。

生化標(biāo)記基因位點(diǎn)的測(cè)定結(jié)果顯示，酯酶-1等11個(gè)生化標(biāo)記位點(diǎn)均為純合型，符合國(guó)家近交系質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，參照目前常用的近交系大鼠品系的生化遺傳概貌，未發(fā)現(xiàn)與TSC大鼠的生化標(biāo)記基因位點(diǎn)完全相同的，TSC大鼠具有獨(dú)特的遺傳特征，所測(cè)定的遺傳概貌可作為該品系大鼠今后遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)的判定指標(biāo)。

現(xiàn)代生物技術(shù)的高速發(fā)展，檢測(cè)手段和檢測(cè)儀器的不斷更新，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)已經(jīng)不局限于傳統(tǒng)的生化標(biāo)記檢測(cè)、皮膚移植法、毛色基因測(cè)試以及下頜骨測(cè)量法了[12]。分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛的運(yùn)用到檢測(cè)中，微衛(wèi)星標(biāo)記、SNP標(biāo)記等DNA標(biāo)記方法越來(lái)越普遍的被用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量檢測(cè)，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，且僅需要提取少量血液樣本即可實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量檢測(cè)，無(wú)需安樂(lè)死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，符合動(dòng)物福利和3R原則，主要應(yīng)用于近交系動(dòng)物的遺傳分析，但尚未形成標(biāo)準(zhǔn)[13]。皮膚移植法和生化標(biāo)記檢測(cè)法自上世紀(jì)90年代開(kāi)始使用至今，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量控制方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。