SPF小鼠上呼吸道常見細菌的分離鑒定及攜帶率分析

魏天文 胡芹寶 宣俊文 李晨江 周小江 呂 銘 張新創

(蘭州生物制品研究所有限責任公司 甘肅省疫苗工程技術研究中心，蘭州 730046)

《實驗動物微生物學等級及監測》國家標準是按實驗動物自身所攜帶的病原微生物或條件致病和對科學實驗干擾大的病原，將實驗動物分為普通級動物conventional(CV)animal、清潔動物clean(CL)animal、無特定病原體動物specific pathogen free(SPF)animal、無菌動物 germ free(GF)animal[1]。其中，細菌檢測的采樣來源于氣管分泌物、腸內容物兩個部位。常規檢測流程是：采樣、分離培養、生化鑒定、血清學檢測等步驟，最終以能否檢出國家標準中需排除的病原微生物來判定是否符合相應級別實驗動物。至于分離到的其他細菌，國家標準中未作鑒定要求，通常不再做鑒定。自2016年以來我們對本單位SPF小鼠繁殖單元進行常規細菌檢測時，除檢測國標中要求檢測的細菌外，對小鼠上呼吸道分離到的細菌均進行了分離鑒定和統計，累計檢測KM小鼠640只，NIH小鼠160只，BALB/c小鼠160只，得出了SPF小鼠的上呼吸道常見細菌及攜帶率。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF小鼠均由本所實驗動物室生產，實驗動物生產許可證號：SCXK(甘)2017-0001。體質量18～22 g。

1.2 主要試劑與儀器

鮮血營養瓊脂培養基(血平皿)、麥康凱培養基、三糖鐵培養基均由本所培養基室提供或自制；細菌微量生化反應管、革蘭氏染液購自杭州濱和微生物試劑有限公司，生產許可證號：浙食藥監械生產許20100290；Vitek 2 compact全自動細菌鑒定分析儀(法國生物梅里埃公司)；Vitek 2 compact革蘭氏陽性球菌GP鑒定卡；Vitek 2 compact革蘭氏陰性菌GN鑒定卡、生物安全柜、超凈工作臺、恒溫培養箱和顯微鏡。

1.3 采樣

小鼠采血樣后處死，在生物安全柜內無菌解剖取咽、喉部氣管分泌物接種在血平皿培養基上，放入(37 ± 1)℃恒溫培養箱培養18～24 h。

1.4 分離鑒定

在超凈工作臺內肉眼觀察上述培養物的菌落形態，挑取單顆菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢，挑取單個菌落用血平皿培養基分純培養，分純的培養物用麥康凱培養基、三糖鐵培養基及生化反應管等傳統方法進行鑒定。同時按照鏡檢結果分別采用Vitek 2 compact革蘭氏陽性菌GP鑒定卡、Vitek 2 compact革蘭氏陰性菌GN鑒定卡進行全自動生化鑒定。

2 結果

2.1 小鼠氣管分泌物檢測及菌群培養

對SPF小鼠氣管分泌物進行細菌培養鑒定發現，其上呼吸道常見細菌有8種。細菌在血平皿上培養24 h的菌落形態如圖1所示，革蘭氏染色的菌體形態如圖2所示。

圖1 細菌在血平皿上培養24 h的菌落形態注：A.毗鄰顆粒鏈菌；B.松鼠葡萄球菌；C.木糖葡萄球菌；D.大腸埃希氏菌；E.陰溝腸桿菌Fig.1 The colony morphology of bacteriacultured on blood plates for 24 hoursNote: A. Granulicatella adiacens；B. Staphylococus sciuri；C. Sta.xylosus； D.Escherichia coli；E. Enterobacter cloacae

圖2 革蘭氏染色的菌體形態Fig.2 The mycelial morphology in Gram staining

2.1.1毗鄰顆粒鏈菌(Granulicatellaadiacens)：在血平皿上培養24 h菌落形態呈針尖大小，周邊有輕微溶血或不明顯。革蘭氏染色短鏈狀或長鏈狀陽性球菌或桿菌，也有部分單個、成雙的散在排列。Vitek 2 compact全自動細菌鑒定結果提示可信度93%。

2.1.2松鼠葡萄球菌(Staphylococussciuri)：在血平皿上培養24 h菌落形態呈1～2 mm淡黃色菌落)，不溶血。革蘭氏染色陽性球菌，呈葡萄串狀排列。Vitek 2 compact全自動細菌鑒定結果提示可信度99%。

2.1.3木糖葡萄球菌(Sta.xylosus)：在血平皿上培養24 h菌落形態呈0.5～1 mm白色菌落，不溶血。革蘭氏染色陽性球菌，呈葡萄串狀排列。Vitek 2 compact全自動細菌鑒定結果提示可信度91%。

2.1.4陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)：在血平皿上培養24 h菌落形態呈3～4 mm大而濕潤的黏液狀菌落，不溶血。麥康凱瓊脂上為淡粉紅色菌落。革蘭氏染色陰性粗短桿菌。Vitek 2 compact全自動細菌鑒定結果提示可信度99%。

2.1.5奇異變性桿菌(Proteusmirabilis)：在血平皿上培養24 h菌落形態呈擴散生長或呈遷徙生長，有特殊臭味。革蘭氏染色陰性桿菌。Vitek 2 compact全自動細菌鑒定結果提示可信度99%。

2.1.6大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)：在血平板上培養24 h菌落形態呈3～4 mm灰白色或略帶一些棕黃色菌落，不透明，菌落表面濕潤。革蘭氏染色陰性粗短桿菌。麥康凱瓊脂上為粉紅色菌落。Vitek 2 compact全自動細菌鑒定結果提示可信度96%。

2.1.7不動桿菌(Acinetobacter)：在血平板上培養24 h菌落形態呈2～3 mm灰白色菌落，不透明，菌落表面濕潤。麥康凱瓊脂上為無色菌落。革蘭氏染色陰性桿菌。Vitek 2 compact全自動細菌鑒定結果提示可信度94%。

2.1.8肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)：在血平板上培養24 h呈菌落形態3～4 mm灰白色黏液狀菌落，菌落表面濕潤。麥康凱瓊脂上為粉紅色菌落。革蘭氏染色陰性粗短桿菌。Vitek 2 compact全自動細菌鑒定結果提示可信度99%。

2.2 SPF小鼠上呼吸道常見細菌檢出數及攜帶率

檢測結果見表1所列。

表1 SPF小鼠的呼吸道常見細菌檢出數及攜帶率Table 1 The quantity and carrying rate and of commonbacteria in the respiratory tract of SPF mice

3 討論

《實驗動物微生物學等級及監測》國家標準中規定的SPF小鼠必須檢測及必要時檢測項目共有16項，均為病原微生物或條件致病和對科學實驗干擾大的病原，實際情況下SPF小鼠上呼吸道攜帶有大量的細菌，分離鑒定這類細菌并了解其攜帶率，有助于SPF小鼠群體的微生物質量評估，也為相關科研項目選擇使用SPF小鼠時提供數據支持。

本研究就本單位自2016年以來對SPF小鼠繁殖單元進行常規細菌檢測時，對采集到的上呼吸道細菌均做了進一步的鑒定，得到SPF小鼠上呼吸道常見細菌及攜帶率，從細菌攜帶率看大致可分為四類情況。第一類：毗鄰顆粒鏈菌，攜帶率高達98.6%，幾乎每只小鼠均攜帶；第二類：松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌，攜帶率45%～65%；第三類：包括陰溝腸桿菌、大腸埃希氏菌、奇異變性桿菌，攜帶率25%～45%；第四類：包括不動桿菌、肺炎克雷伯菌等，攜帶率10%以下。按照國家標準規定不同繁殖單元的要求，群體在100～500只，采樣量不少于10只，則每次檢測前三類細菌均能檢出，攜帶率也穩定在一個區間內。證明這幾種細菌在小鼠上呼吸道屬于一種常態存在。

四類細菌大多為非致病菌或正常菌群，很少看到有實驗小鼠感染這類細菌引起疾病的報到。但人有感染毗鄰顆粒鏈菌、松鼠葡萄球菌引起敗血癥的報道[1-2]；而陰溝腸桿菌更是醫院感染的重要病原菌[3]；人感染這類細菌的原因常常是病人已有基礎病，自身免疫力下降或菌群失調引起；奇異變性桿菌在小鼠上分離報道多與實驗動物微生物檢測相關[4]；不動桿菌廣泛分布于外界環境中，分離鑒定過程中能檢出瓊氏不動桿菌、魯氏不動桿菌及鮑氏不動桿菌；大腸埃希氏菌是人和動物腸道中的正常棲居菌，能檢出也屬于正常。

肺炎克雷伯菌是國標中要求SPF小鼠必須排除的細菌，從檢出結果看NIH小鼠繁殖單元、BALB/c小鼠繁殖單元均有檢出，檢出率不足3%。這個檢出率和劉麗達等[5]報道的結果相近，此菌在長達幾年的檢測過程中，有時能檢出，有時檢不出，說明該菌在整個動物群體中始終處于一種低水平攜帶狀態，并沒有因為有檢出而出現攜帶率上升的趨勢，如按照現行國家標準只要有檢出就判定這個群體達不到SPF標準，但從另外一個角度我們認為對于這種人和動物呼吸道和消化道寄生性條件致病菌[6]，是否可以用一種定量的標準，如以攜帶率為限定，用來判定動物群體是否符合標準更客觀一些？

分離培養、生化鑒定是細菌檢測的經典方法，雖然受各種因素的制約，靈敏度受影響，但檢測結果的準確性使此方法一直都在沿用。這幾年來只是常規檢測，沒有涉及到微需氧菌和厭氧菌的培養，因此得到的結果均為需氧菌并且只限于上呼吸道。作為實驗動物生產單位，在提供實驗動物質量合格證的同時若能再附一份全方位的實驗動物常見細菌及攜帶率等相關信息，將更有助于為SPF小鼠群體的微生物質量評估及相關科研項目選擇使用SPF小鼠時提供支持，這些工作有待于以后逐步完善。