遺傳修飾小鼠模型基因型鑒定技術要點介紹*

劉甦蘇 王辰飛 岳秉飛 李冠名 范昌發

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 102696)

遺傳修飾小鼠模型是基礎和應用科學研究中不可或缺的工具，在研究人類疾病相關基因功能、疾病表型、診斷及治療等方面都起著重要作用[1]。近年來，動物模型制作成為研究熱點，針對小鼠的基因修飾技術也在不斷更新，出現了各種類型的遺傳修飾小鼠模型，比較常見的分為隨機轉基因小鼠、條件性基因敲入小鼠、基因敲除小鼠三類[2-5]。由于制作方法不同，其基因型鑒定方法也不一樣，目前很多實驗人員并不能很好的掌握該類實驗的技術要點，從而導致基因型鑒定工作存在混亂無序的現象。本文從基因型鑒定實驗總體原則、三類模型的設計原理、鑒定引物設計原則及結果判定這幾個方面介紹了基因型鑒定技術要點，規范基因型鑒定技術方法，保證動物實驗材料的準確性，從而推動動物模型在基礎和應用科技領域的應用與發展。

1 基因型鑒定實驗總體原則

1.1 DNA模板的質量控制

DNA模板的質量控制是基因型鑒定實驗中關鍵因素之一，目前多采用苯酚-氯仿提取法、試劑盒法或者更加簡單的煮沸法來提取。選擇具體DNA模板制作方法時，可根據不同的實驗目的來選擇不同的提取方法。如果旨在獲得初步的基因型鑒定結果，可以采用簡單快速的煮沸法提取模板DNA，但此法制備的模板雜質含量較高、濃度較低，有時候擴增困難。而苯酚-氯仿和試劑盒提取法提取的DNA模板質量較高，適合用于較為正式的基因型鑒定實驗[6]。DNA質量與濃度可通過吸光值法判定，DNA的完整性則可以通過電泳判斷。

1.2 PCR反應體系的質量控制

PCR反應體系的制備[7]也是基因型鑒定實驗的重要部分，應要考慮以下幾點：

1.2.1DNA聚合酶的選取：目前市售多種DNA聚合酶，不同的DNA聚合酶，其價格與性能均不同。有的適用于一般PCR擴增，價格較低，但錯配率較高，無法擴增較長的片段。有的DNA聚合酶適合用于擴增長片段，有的適合用于高保真擴增，有的適用于高GC含量的模板DNA擴增，可以根據模板DNA情況，選擇合適的聚合酶與反應體系。

1.2.2退火溫度的優化：一對新合成的引物會給出參考Tm值，但為了穩定起見，建議對其退火溫度優化，可采用梯度PCR儀，通過設置不同的退火溫度的辦法，獲得最佳的退火溫度。目的條帶清晰，雜帶少或者無可判定為合適退火溫度。所用引物一般采用無菌水稀釋到要求的濃度，分裝到不同的EP管里，-20 ℃保存。

1.2.3DNA模板濃度的優化:DNA模板濃度的優化也較重要，應盡量保證核酸純凈并控制濃度：濃度太低模板量不足，濃度太高雜質含量也高，易影響Taq酶活性。

1.2.4PCR循環數的優化：PCR循環數以不超過35個為宜，用以減少假陽性擴增的可能性。

1.2.5PCR反應體系中一般需要設置陽性對照、陰性對照(即以H2O為模板)、空白對照(即不加模板)。當陽性對照擴增獲得目的條帶，而陰性及空白對照未獲得目的條帶時，基因型鑒定結果可靠，否則可能存在交叉污染。

1.3 實驗復檢原則

實驗復檢原則在基因型鑒定實驗中是必需堅持的要點，并且要從模型剪尾開始，重新提取DNA，重新開始PCR基因型鑒定。比較前后兩次鑒定結果是否吻合。如果不吻合，需要重復一次。基因型鑒定結果要仔細標記到對應的動物上，所以每只轉基因動物的唯一標識顯得非常重要。

1.4 實驗室DNA交叉污染預防

由于鑒定實驗室長期重復鑒定工作，空氣中容易形成特定DNA片段的氣溶膠，易產生交叉污染現象，體現為PCR陰性對照中能擴增出陽性條帶，測序結果也顯示為目標條帶[8-10]。避免這個問題，應該從實驗室通風設計、實驗室布局、實驗室操作等方面來預防。當交叉污染發生時，可以采用加強通風、紫外照射、特殊化學試劑處理等辦法進行消除。

2 隨機轉基因小鼠模型的基因型鑒定設計要點

通過實驗手段將外源基因導入到小鼠早期胚胎，并使其整合到基因組中，獲得的能穩定遺傳該外源基因的小鼠品系稱為轉基因小鼠[11-12]。該小鼠模型的基因型鑒定比較簡單，只需要在插入基因片段內設計上下游引物即可。一般擴增的目的片段為500 bp左右，其引物設計示意圖見圖1。結果的判讀：有目的條帶者為陽性遺傳修飾動物模型，否則為陰性，同時應確認陰性對照組未擴增。

圖1 隨機轉基因小鼠模型鑒定引物設計示意圖注：紅色片段表示插入DNA片段Fig.1 Schematic diagram of primer design ofrandom transgenic mice modelNote:The red fragment represents the inserted DNA fragment

3 條件性基因敲入小鼠模型基因型鑒定設計要點

條件性基因敲入小鼠模型的設計原理，一般是定點插入在Rosa 26位點，在目標基因(以PSGL1基因為例，圖2)前插入了loxp-stop-loxp元件，該元件能阻止啟動子CAG 蛋白啟動PSGL1基因的表達。要正確表達PSGL1基因，則需要與特定Cre小鼠交配，刪除lox-stop-lox元件。另外，該模型由于是條件性基因敲入，可以通過與不同帶Cre重組酶的工具鼠交配，獲得在生物體不同的細胞、組織、器官或者在不同的發育階段表達的小鼠模型。所以該類模型的基因型鑒定需要分為兩部分介紹[13-14]。

3.1 含有目的基因但不表達的基因敲入小鼠模型的基因型鑒定設計要點

與Cre重組酶工具鼠交配之前的模型的基因型鑒定應設計兩對引物，先在插入位點設計一對引物，引物名稱為Rosa-GT-F與Rosa-GT-R，后在WPRE元件上設計另一對引物為WPRE-F與WPRE-R。

對其鑒定結果的判定比較復雜，需符合以下條件：兩對引物同時擴增目的片段則判定為陽性雜合小鼠；Rosa-GT-F與Rosa-GT-R這對引物無擴增，WPRE-F與WPRE-R能擴增出片段，二者同時成立，則判定為陽性純合小鼠；Rosa-GT-F與Rosa-GT-R這對引物能擴增目的片段，但WPRE-F與WPRE-R無擴增片段，則判定為野生型小鼠。具體判定結果見表1，對于樣本1： Rosa-GT這對引物有擴增、WPRE這對引物無擴增，則判定為野生型。對于樣本2：Rosa-GT和WPRE這2對引物均有擴增，則判定為雜合陽性。對于樣本3：R Rosa-GT這對引物無擴增、WPRE這對引物有擴增，則判定為純合陽性。陰性水對照則沒有任何擴增條帶。

圖2 條件性敲入模型設計原理以及基因型鑒定引物設計Fig.2 Schematic diagram of primer design of conditional knockin mice model

表1 與Cre重組酶工具鼠交配之前的模型的基因型鑒定判定Table 1 Genotype identification of mice beforemating with the Cre tool mice

3.2 與Cre小鼠交配、啟動目的基因表達的基因敲入小鼠模型的基因型鑒定設計要點

與Cre重組酶工具鼠交配之后，獲得的小鼠中應去除了lox-stop-lox原件，同時引入Cre基因。這類模型應分別在Cre片段、WPRE片段以及插入片段內設計引物。

該類鑒定結果的判定原則：三對引物均有目的片段擴增判定為陽性雜合子，Cre基因和WPRE這兩對引物有擴增判定為陽性雜合子。具體判定結果見表2,對于樣本1：Rosa-GT、WPRE與Cre這三對引物有擴增、則判定為雜合陽性。對于樣本2：WPRE與Cre這兩對引物有擴增，Rosa-GT這對引物無擴增，則判定為純合陽性。對于樣本3：在Cre這對引物沒有擴增的情況下，陰性水對照則沒有任何擴增條帶。

表2 與Cre重組酶工具鼠交配之后的模型基因型鑒定判定Table 2 Genotype identification of mice aftermating with the Cre tool mice

4 基因敲除小鼠模型基因型鑒定設計要點

基因敲除動物模型從最為經典的干細胞介導的同源性重組到各種DNA內切酶系統，如TALEN、ZFN和CRISPR/Cas9等技術均有應用[15-18]。由于不同方法制作的動物模型其基因型鑒定技術方法不同，所以本文分別介紹目前應用最多的通過干細胞同源性重組和CRISPR/Cas9基因編輯技術兩大類模型。

4.1 同源性重組基因敲除動物模型基因型鑒定設計要點

采用干細胞打靶技術制作的敲除模型的基因型多根據同源重組原理，將帶啟動子的Neo基因(編碼新霉素neomycin的抗性基因)插入目標基因的外顯子中，在失活目標基因同時會引入一個新的基因Neo。在這類模型基因型鑒定的引物設計時，上游引物應在Neo基因內，下游引物應在小鼠基因組內，以P53基因為例(圖3)。

圖3 基于同源重組技術的基因敲除模型的引物設計Fig.3 Primer design for gene knockout model based on homologous recombination technique

該模型的鑒定結果判定原則：純合陽性小鼠應該只能擴增Neo基因中的目的片段，而雜合陽性小鼠野生型和Neo基因這兩對引物都能擴增。野生型小鼠因缺乏Neo基因，故無法擴增出條帶；為了結果可靠，可以同理在插入基因另外一側設計一對引物，兩對引物的擴增結果一致再進行判定。具體判定結果見表3，對于樣本1：WT這對引物無擴增、Mut-Neo這對引物有擴增，則判定為純合陽性。對于樣本2：WT這對引物無擴增、Mut-Neo這對引物有擴增，則判定為雜合陽性。對于樣本3：WT這對引物有擴增、Mut-Neo這對引物無擴增，則判定為野生陰性，陰性水對照則沒有任何擴增條帶。

表3 同源重組技術基因敲除模型的基因型鑒定判定Table 3 Genotypes of knockout models usinghomologous recombination technique

4.2 CRISPR/cas9打靶基因敲除小鼠模型基因型鑒定設計要點

采用CRISPR/cas9技術制作的基因敲除小鼠模型，無需引入Neo基因，只需在敲除片段兩側設計引物，利用敲除部分片段后變短的原理來區分野生型與敲除動物。敲除動物的純合子與雜合子宜采用同樣設計方法進行基因型鑒定，純合子只有一種帶型，雜合子有兩種帶型。具體判定結果見表4，對于樣本1：WT這對引物無擴增、Mut這對引物有擴增，則判定為純合陽性。對于樣本2：WT這對引物無擴增、Mut這對引物有擴增，則判定為雜合陽性。對于樣本3： WT這對引物有擴增，Mut這對引物無擴增、則判定為野生陰性，陰性水對照則沒有任何擴增條帶。

表4 CRISPR/cas9技術基因敲除模型的基因型鑒定判定Table 4 Genotypes of knockout models usingCRISPR/cas9 technique

5 結語

遺傳修飾技術的發展，推動了各類遺傳修飾小鼠模型在物醫學研究的的步伐，幾乎所有的醫學研究都利用了動物模型。在日常工作中，我們往往存在模型如何繁育的困擾，所以明確模型的目標基因，對于使用小鼠模型來說是非常重要的[19]。另外，模型研究離不開兩個關鍵詞：基因型和表型。模型的基因型改變，才可能會導致小鼠某些生理過程的變化，從而進一步推斷目標基因的功能用以進行生命研究。基因型是因，表型是果。基因型鑒定實驗是成就“因果關系”的基石。如果基因型鑒定實驗出現差錯，那么后續所有的實驗結果都將謬以千里。

本文著重介紹了基因型鑒定實驗總體原則，并通過實例介紹了三類常用模型的基本鑒定方法。在介紹的方法中小鼠模型的DNA提取及PCR體系制備是比較關鍵的要素，應該引起實驗人員的重視，綜合時間成本與成功率兩大因素，推薦用裂解液和蛋白酶K處理鼠尾后將DNA純化之后，采用聚合酶鏈式反應加凝膠電泳方式進行PCR鑒定，從而降低污染的概率[20-21]。另外，在獲得小鼠模型進行實驗前，一定要明確小鼠的設計方案，制定好明確的基因型鑒定方法后才開始后續動物實驗。作者單位目前已經開展了部分遺傳修飾動物模型基因型鑒定技術標準的申請工作，且得到了相關行業的立項通知，希望能通過標準的立項引起廣大動物模型實驗人員的重視，進一步規范基因型鑒定技術實驗，推動遺傳修飾小鼠模型在生命科學領域的應用廣度及深度。