基于生物信息學方法篩選EV71 感染的關鍵基因和通路＊

單志鳴，楊俊梅，孫紅啟，李鐵威，成怡冰

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）作為一種常見兒童感染性疾病，多累及2～5 歲兒童，主要表現為口腔黏膜潰瘍性皰疹及四肢末端水皰樣皮疹，主要病原為腸道病毒，常見為柯薩奇病毒 A 組 16 型（Coxsackie virus A16，CA16）和腸道病毒 71 型 （Enterovirus 71，EV71），EV71 不僅引起手足口病，而且可引起嚴重中樞神經系統并發癥，如腦膜炎、腦炎、急性遲緩性癱瘓等［1］。隨著生物信息學的快速發展，通過分析篩選可以找到致病后差異表達的基因或蛋白，進一步探索其在疾病發生過程中的分子機制。筆者通過分析美國國立信息技術中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）下屬的基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）［2］中 EV71 感染組和對照組的基因表達差異，探討EV71 在感染宿主細胞后差異表達的基因，并分析這些差異表達基因所參與的生物學過程，以及在EV71 感染過程中發揮關鍵作用的通路途徑，更好地揭示EV71 感染人體的分子機制，為后續研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 數據來源在GEO 數據庫中以“EV71”檢索，對檢索結果按照如下標準篩選：（1） 至少3 個生物學重復；（2）研究設計有對照組。篩選后得到數據集GSE136668，其包含EV71 感染人扁桃體上皮細胞組和對照組共6 個樣本，使用HiSeq X Ten （Homo sapiens）平臺對提取的RNA 進行高通量測序，下載基因矩陣文件后續分析。

1.2 篩選差異表達基因用在線分析網站NetworkAnalyst （https：//www.networkanalyst.ca/Network Analyst/）［3］基因表達矩陣分析模塊 edgeR1 對下載的基因矩陣文件進行差異基因分析，設置篩選標準為：感染組與對照組相比差異倍數2 倍以上，P＜0.05（log|FC|＞1，P＜0.05）。

1.3 差異基因GO 分析和KEGG 分析對符合篩選標準的差異基因在NetworkAnalyst 網站的基因列表分析模塊做功能富集分析，基因本體（gene ontology，GO）分析主要是對基因的生物學功能進行注釋分析，主要包括分子功能（molecular function，MF）、細胞組分（cellular components，CC）和生物學過程（biological process，BP）。京都基因與基因組百科全書 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 分析是將基因組信息與基因高級功能信息聯系起來，系統分析基因參與的生物學功能，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

1.4 蛋白互作網絡構建（protein-protein interaction，PPI）通過構建PPI 網絡能夠分析差異表達基因的蛋白互作關系和關鍵基因模塊。用差異表達基因導入 STRING 在線分析網站（http：//www.stringdb.org/）［4］，對基因所編碼蛋白之間的相互作用展示，篩選條件為：互作得分＞0.4；將互作文件導入Cytoscape 軟件［5］，用 MCODE 插件篩選關鍵基因模塊，設置參數 degree cut-off 值為 2，node score cutoff 值為 0.2，K score 值為 3，Max.Depth 值 為 100，Cytohubba 插件篩選MCC 等級前十的hub 基因。

2 結 果

2.1 感染組與對照組差異基因用NetworkAnalyst分析得到9443 個差異表達基因，4703 個基因表達下調，4740 個基因表達上調，以 log|FC|＞1，P＜0.05為條件篩選后得到251 個，其中173 個基因上調，78 個基因下調，上調和下調logFC 排序前10 見表1。

2.2 差異基因GO 分析和KEGG 分析結果GO分析結果顯示分子功能模塊主要富集在蛋白結合、DNA 結合、核染色質結合、細胞之間鈣調結合、連接酶活性、微管蛋白結合和調節復合物結合，細胞組分主要富集在細胞核、細胞質、胞質、核質、核仁、中心體、蛋白復合體、細胞之間粘著結合、細胞骨架和微管，生物學進程主要富集在DNA 模板轉錄、DNA轉錄調節、細胞分裂、負相調節DNA 轉錄、凋亡進程、有絲分裂細胞核分離、姐妹染色體結合、細胞對DNA 損傷應激反應和絲裂原激活蛋白激酶激活（表2）；KEGG 分析結果主要富集在沙門氏菌感染、RNA轉運、mRNA 監視通路、MAPK 信號通路、p53 信號通路、癌癥中轉錄失調通路、EB 病毒感染、百日咳等通路途徑（表3）。

2.3 蛋白互作網絡構建結果通過STRING 在線分析，差異基因互作網絡有187 點，433 個連線（圖1），使用Cytoscape 軟件MCODE 插件分析得到核心互作模塊（圖2）以及cytohubba 插件篩選出MCC 等級前 10 的 hub 基因（圖3），分別為 CENPF、KNTC1、BRCA1、HELLS、KIF20B、CASC5、ECT2、KIF14、ASPM、CENPJ。

圖1～3 見封三。

2.4 關鍵基因BRCA1 調控靶基因分析對hub基因的功能和參與生物學途徑分析發現，這些關鍵基因參與病毒感染相關的免疫調控和細胞凋亡過程，此外BRCA1 編碼的轉錄因子既可以負向調節促炎反應調控通路靶基因，也可正向調節表皮生長因子受體（EGFR）、胰島素樣生長因子（IGF-1）等促進機體修復的靶基因表達，結果如圖4 所示。

表1 差異基因列表

表2 差異基因GO 分析結果

表3 差異基因KEGG 分析結果

圖4 BRCA1 調節靶基因結果

3 討 論

手足口病作為一種常見的兒童感染性疾病，EV71 是引起手足口病最常見的致病病毒之一，常引起重癥手足口患兒發生無菌性腦膜炎、腦干腦炎、神經源性肺水腫等嚴重并發癥［6］，嚴重威脅著兒童的身體健康，深入研究EV71 引起神經系統癥狀的分子機制對于疾病的診斷和治療具有重要意義。隨著高通量測序技術的發展，研究疾病中差異表達基因更加便捷。

利用公共數據庫中的測序數據，綜合分析EV71 感染組和正常對照組的差異表達基因，提示其可能參與EV71 感染人體的生理過程并發揮著重要的生物學功能。通過在線分析網站Network Analyst 對下載的基因矩陣文件進行基因名轉換和標準化，分析感染組和對照組差異表達基因，按照2倍以上的變化和P＜0.05 為篩選條件，得到差異表達基因251 個，其中173 個基因表達上調，78 個基因表達下調，進一步對251 個差異基因做基因的富集分析，預測了這些差異基因參與的生物功能和通路，GO 分析結果顯示這些差異基因可能通過影響蛋白質DNA 結合、細胞之間鈣調結合和粘著以及微管蛋白結合參與感染的進程，還可能通過調節DNA 轉錄、細胞分裂與凋亡進程和細胞對DNA 損傷應激反應影響感染的過程。KEGG 通路富集結果顯示這些差異基因參與的調節通路有沙門氏菌感染和EB 病毒感染以及 MAPK 信號通路和p53 信號通路等，MAPK 信號通路廣泛參與調節細胞的多種生理過程，包括炎癥、應激、細胞生長分化和凋亡。研究表明［7］EV71 感染人體后通過激活體內的固有免疫系統促進一系列炎性細胞因子的分泌，干擾病毒的復制和參與調節病毒的免疫逃逸機制并會激活 MAPK 信號通路。xie 等報道［8］EV71 感染后會激活p38、ERK1/2 和JNK1/2 信號通路，進而促進白介素6 和白介素8 等細胞因子的釋放，zhang 等的研究也表明體外實驗中p38 抑制劑可以減弱EV71誘導的細胞凋亡。還有兩項研究［9，10］結果發現 EV71的非結構蛋白3C 可以影響MAPK 下游信號分子結構，從而抑制細胞因子的產生，因此，MAPK 信號通路參與調節細胞因子的釋放和感染細胞的凋亡，在EV71 感染的過程中具有重要作用。進一步對251個差異基因構建了蛋白互作網絡，篩選感染相關的關鍵基因，Cytohubba 等級前十的基因分別為CENPF、KNTC1、BRCA1、HELLS、KIF20B、CASC5、ECT2、KIF14、ASPM、CENPJ，并且它們也存在于核心互作模塊，更進一步表明這10 個基因可能作為關鍵基因參與EV71 感染的過程，對其功能注釋分析發現基因BRCA1 編碼蛋白為轉錄因子。轉錄因子作為重要的生命過程調節蛋白，可以通過與基因的啟動子區域結合調控基因的表達水平。通過JASPAR 網站［11］分析發現，BRCA1 編碼的轉錄因子負向調節的靶基因中 EGFR 依賴的信號通路是重要的促炎反應調控通路，在病原體感染時EGFR 基因表達如果受到抑制，會導致抵抗病原體的能力下降。一項研究［12］就證明miR-27a 可以通過靶向下調EGFR 基因表達，從而抑制EV71 病毒的復制；另一個靶基因IRF3 可以促進EV71 感染后促炎因子和干擾素的生成［13］，抑制這些基因的表達都有利于機體對病原的抵抗。此外，BRCA1 還可以正向調節靶基因SATA1/2 以及E2F6 等。在干擾素刺激后，作為調控因子SATA1/2 通過增加促進炎癥因子生成來抵抗病毒復制［14］，同樣E2F6 可以調節細胞的增殖分化和調節細胞凋亡［15］。以上結果提示 BRCA1 作為關鍵調節因子可能參與EV71 感染的重要過程。