槲皮素對糖尿病大鼠視網膜病變的抗氧化作用及其機制

王冬艷，彭建明，季 琰，羅惠媛，葉記林

視網膜病變包括黃斑水腫、玻璃體腔出血和視網膜新生血管性青光眼，嚴重影響患者的視力，糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病的嚴重慢性并發癥，也是患者失明的主要原因之一［1］。長期高血糖導致蛋白激酶C、糖化血紅蛋白和多元醇代謝物增加，影響視網膜生理功能，引發氧化應激損傷［2］。高糖培養的糖尿病大鼠模型和人視網膜色素上皮均顯示視網膜脂質過氧化物明顯增加，抗氧化酶降低。有研究表明通過抗氧化和抗炎作用可以減輕糖尿病大鼠視網膜損傷［3］。

槲皮素（Quercetin，QUE）是黃酮類化合物，在許多中藥如菟絲子和毛丹皮中常見，具有神經保護、抗氧化、抗炎、清除自由基等多種藥理活性，目前，QUE 對糖尿病患者和糖尿病動物模型的糖脂代謝調節和抗氧化作用已受到廣泛關注［4］。該研究建立糖尿病大鼠模型，觀察QUE 對糖尿病大鼠視網膜的保護作用，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料QUE （成都必特生物科技有限公司，批號 110878-201611，純度≥98%）；4%多聚甲醛和2.5%戊二醛 （北京索拉比奧生命科學技術有限公司）；1%骨微酸（上海哈林生物科技有限公司）；枸櫞酸鉛和2%醋酸鈾酰 （上海榮創生物科技有限公司）；手術顯微鏡（德國萊卡，型號：M525F40）；微體（德國萊卡，型號：EMUC7）；倒置生物顯微鏡（上海光學儀器廠，型號：37X F）；電泳儀（北京劉毅生物科技有限公司。模型：DYCZ-40D）；蘇木精-伊紅染色（武漢博希德生物工程有限公司）；BCA 蛋白檢測試劑盒、裂解液、PVD F 膜和化學發光試劑、Bcl-2、Bax 和P53 抗體（上海貝約時間生物技術）。

1.2 方 法

1.2.1 動物造模及給藥 取40 只清潔雄性SD 大鼠（來自南京醫科大學動物中心），體重（160±20）g。隨機分為正常對照組（Normal）、糖尿病組（Model）、低劑量 QUE 組（QUE-L）和高劑量 QUE 組（QUEH），每組 10 只。所有大鼠自適應喂養 1 周。糖尿病組、QUE 低劑量組和高劑量組大鼠禁食12 h 后腹腔注射60 mg/kg 鏈脲佐菌素，建立糖尿病模型。正常對照組大鼠注射等量生理鹽水，在72 h 后，用自動血糖分析儀測量尾靜脈血糖，并將＞16.7 mmol/L 的作為成功的糖尿病模型。造模成功后第2 天開始，QUE 組每天腹腔注射QUE，低劑量組10 mg/kg，高劑量組50 mg/kg。正常對照組和糖尿病組大鼠不接受治療，持續12 周。

1.2.2 視網膜病變的取材及觀察 末次給藥后，給大鼠服用過量的麻醉劑。在立體顯微鏡下無菌摘除右眼球，分離視網膜組織，HE 染色：4%多聚甲醛固定24 h，染色蘇木精5～10 min，用蒸餾水沖洗后，用伊紅染色5～10 min，用蒸餾水再次沖洗玻片，用梯度乙醇溶液脫水后，觀察視網膜病理變化。

1.2.3 視網膜組織SOD 和MDA 水平 分別取每組視網膜組織50 μg，研磨成組織勻漿，低速離心（2000 r/min），再取上清液。按試劑盒說明書加入樣品，混勻。用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD 和MDA 水平。

1.2.4 Western Blot（WB）對 Bcl-2、Bax 和 P53 蛋白表達水平的影響 取視網膜組織50 μg，在冰上加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液400 μl，研磨30 min提取總蛋白，在10000 r/min 下離心10 min 取上清液，進行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；跨膜后，用5%脫脂奶粉在4 ℃下阻滯2 h，加入一次抗體（稀釋比 1∶1000），過夜保存。將二次抗體（稀釋 1∶2000）室溫孵育1 h。利用ECL 化學發光進行自我開發，獲取圖像。通過樣品靶蛋白的光密度與內參帶光密度的比值，比較不同樣品的相對表達率。

1.3 統計分析用SPSS 20.0 統計軟件分析數據。計量數據以（±s）表示。組間比較采用單向方差分析。具有方差齊性的2 組比較采用LSD-t 檢驗。

2 結 果

2.1 大鼠視網膜形態學變化正常對照組大鼠視網膜組織結構清晰，內外核層細胞排列規則； 糖尿病大鼠視網膜組織層分辨率差，神經纖維層水腫，內外核層排列松散； 低劑量組視網膜細胞基本分層，細胞排列良好，內外核層輕度紊亂；高劑量組與低劑量組相比，大鼠視網膜組織結構進一步改善。如圖1 所示。

圖1 見封三。

2.2 大鼠視網膜組織SOD 和MDA 水平糖尿病大鼠視網膜組織SOD 水平顯著降低，MDA 水平顯著升高（P＜0.05）。低劑量 QUE 組和高劑量 QUE 組SOD 水平顯著升高，MDA 水平顯著降低 （P＜0.05）。見表1。

2.3 大鼠視網膜組織凋亡蛋白表達水平糖尿病大鼠視網膜組織中Bcl-2 蛋白表達明顯降低，Bax和 P53 明顯升高（P＜0.05）。低劑量和高劑量 QUE 組Bcl-2 蛋白表達顯著增加，高劑量QUE 組Bax 和P53 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。見圖2。

表1 各組大鼠視網膜組織SOD 和MDA 水平（±s）

表1 各組大鼠視網膜組織SOD 和MDA 水平（±s）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與 QUEL 組比較，＆P＜0.05。

組別Normal Model QUE-L QUE-H F 值P 值n 10 10 10 10--SOD（U/mg） MDA（mmol/mg）564.33±40.57 7.06±1.43 344.51±19.87＊ 24.16±2.46＊442.81±23.51# 17.15±1.29#493.72±38.49#＆ 12.56±1.18#＆77.42 150.76＜0.05 ＜0.05

圖2 見封三。

3 討 論

糖尿病微血管并發癥主要包括DR 和糖尿病腎病。根據視網膜是否形成新生血管分為非增殖期糖尿病視網膜病變（NPDR）和增殖性糖尿病視網膜病變 （PDR）。NPDR 有微血管損傷，出現毛細血管擴張和滲漏、棉絮斑、硬性滲等視網膜內微血管異常病變［5］。若未予治療，可演變為增殖期，形成新生血管、玻璃體積血或前視網膜出血，造成患者視力嚴重下降，增加失明風險。對于DR 的發生現普遍認為高血糖、胰島素抵抗、遺傳因素是主要致病主要因素。葡萄糖的過度轉運改變視網膜細胞的生理作用，糖代謝障礙引起毛細血管基底膜增厚、內皮細胞增生以及視網膜血流量的自我調節機制受損傷。高血糖時，自由基產生過多，抗氧化系統負荷過重，從而損傷內皮細胞、引起血管滲出、刺激新生血管生成等［6］。

視網膜由視網膜神經上皮和視網膜色素上皮（RPE）組成，任何原因引起的RPE 損傷都會對視覺功能產生不可逆轉的影響。糖尿病患者視網膜組織中的氧化應激水平增加，影響視網膜神經上皮和RPE 層的正常生理功能，視網膜對氧化應激高度敏感［7］。高糖時神經細胞增殖活性受抑制，研究表明，QUE 可提高被抑制的神經上皮細胞的增殖活性，減少氧化應激損傷［8］。QUE 亦可通過去除體內和體外模型的 ROS 來抑制炎癥小體的激活［9］。該研究結果表明，QUE 干預的糖尿病大鼠視網膜形態結構優于糖尿病大鼠。糖尿病大鼠視網膜組織層分辨率差，神經纖維層水腫，內叢狀層、內外核層排列疏松。經過QUE 干預后，視網膜各層細胞排列更加規則。

SOD 和MDA 是人體主要的抗氧化酶，SOD 與自由基清除呈正相關，MDA 含量可反映自由基水平。該研究證實，QUE 干預糖尿病大鼠可提高SOD水平，降低MDA 含量，從而減少病理條件下組織氧化損傷。

細胞凋亡為細胞死亡的特殊類型，是一種基本生物學現象。研究表明Bax/Bcl-2 和P53 蛋白是調控細胞凋亡的關鍵蛋白，在氧化應激介導的細胞凋亡反應中，Bcl-2 起著重要的作用，是調節線粒體凋亡途徑的重要分子，具有潛在的抗凋亡作用。而Bax和P53 的表達水平直接反映了細胞凋亡的程度。糖尿病組大鼠視網膜組織中Bcl-2 蛋白減少，Bax 和P53 蛋白增加，表明鏈脲佐菌素可誘導組織凋亡。在QUE 干預后，Bcl-2 表達增加，Bax 和 P53 表達降低，進一步證實QUE 可抑制高糖誘導的視網膜組織凋亡。