基于網絡藥理學研究赤芍治療動脈粥樣硬化的作用機制*

任玲，曹煥澤，紀文巖

1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355； 2.青島市中醫醫院，山東 青島 266033

動脈粥樣硬化是一種以內膜斑塊為特征，可累及大中動脈的血管內膜疾病，是引起冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、頸動脈疾病和外周動脈疾病最常見的潛在原因之一。高膽固醇血癥、低密度脂蛋白升高、高密度脂蛋白降低、脂質氧化、高血壓及炎癥是動脈粥樣硬化的最易感因素[1]。赤芍，又名山芍藥、草芍藥，是毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall或川赤芍PaeoniaveitchiiLynch的干燥根[2]，性微寒，味苦，歸肝經，功能清熱涼血、散瘀止痛。《神農本草經》認為芍藥可除血痹、止痛。陶弘景將芍藥分為赤、白兩種，認為“芍藥赤者小利”。白芍的作用偏于養，能斂陰養營；赤芍的作用偏于活，可散邪活血。研究表明赤芍的化學成分包含萜類及其苷、黃酮類及其苷、鞣質類、揮發油類、酚酸及其苷等，有保肝、抗炎、抗腫瘤、抗血栓、抗氧化、抗內毒素等多種藥理作用，且對心血管系統及神經系統有保護作用[3]。

Hopkins[4]認為將化學基因組學與網絡生物學相結合，可形成網絡藥理學來發現藥物或開發輔助藥物設計，能更科學、系統地闡釋藥物的作用機制。中醫的整體觀與新興的網絡藥理學和網絡生物學的關鍵思想有很多共同之處。中藥網絡藥理學是從系統生物學和分子水平的角度發現中藥有效成分，通過將研究范式從目前的“一靶一藥”模式更新為“網絡靶向多組分”模式，為中醫藥從經驗醫學向循證醫學的轉化提供了一種新的研究范式。

1 方法

1.1 篩選赤芍的有效化學成分及靶點通過中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP：http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.pHp)對赤芍的活性化合物進行篩選[5]。以“赤芍”為關鍵詞進行檢索，得到赤芍的全部化學成分及靶點，再以口服生物利用度(oral bioavailabitity,OB)≥30%、類藥性(drug-like,DL)≥0.18為條件篩選出赤芍的有效活性成分及其靶點[6]，使用Uniprot數據庫(http：//www.uniprot.org/)將獲得的靶蛋白名稱轉換成Gene Symbol。

1.2 預測動脈粥樣硬化的靶點在Gene Cards數據庫(http：//www.genecards.org/)和OMIM數據庫(http：//www.omim.org/)分別搜索關鍵詞“atherosclerosis”，得出動脈粥樣硬化的致病靶基因，再把兩個數據庫的檢索結果合并，刪除重復靶點，得到最終結果。

1.3 化合物靶點與疾病的交集將赤芍的有效靶點與動脈粥樣硬化的靶基因相映射，通過R軟件取交集獲得“赤芍”治療動脈粥樣硬化的作用靶點。

1.4 構建中藥調控網絡及PPI網絡根據以上結果，通過Cytoscape3.7.2軟件構建“赤芍-有效成分-動脈粥樣硬化-靶基因”的中藥調控網絡；運用STRING數據庫(https：//string-db.org/)，將赤芍治療動脈粥樣硬化的靶點作為搜索關鍵詞，研究物種限制為人，構建PPI網絡，再應用R軟件計算出連接節點最多的30個基因。

1.5 GO富集分析和KEGG通路分析首先將基因名字轉化為基因ID，再運用Bioconductor生物信息軟件包(http：//www.bioconductor.org/)、R軟件，設定P≤0.05，Q≤0.05分別進行GO富集分析與KEGG通路分析。GO富集分析選取P值前10的條目制圖，KEGG通路分析取P值前20的條目制圖。

2 結果

2.1 赤芍有效成分及作用靶點TCMSP中赤芍化學成分共119個，根據條件篩選出有效成分29個(表1)，靶點681，其中有效靶點123個。疾病與藥物靶基因取交集后共得到72個靶基因。

表1 赤芍的有效成分

2.2 中藥調控網絡運用Cytoscape軟件構建“赤芍-有效成分-動脈粥樣硬化-靶基因”的中藥調控網絡(圖1)。

注：橙色-疾?。痪G色-藥物；藍色-有效成分；黃色-靶基因圖1 中藥調控網絡圖

2.3 構建PPI網絡將72個藥物-疾病交集靶點通過STRING數據庫進行蛋白相互作用的PPI網絡分析(圖2)。PPI中節點數為72個，相互作用連線共518條。用R軟件計算出連接節點最多的30個基因及其連接節點的數目并制作柱狀圖(圖3)。圖3可知赤芍治療動脈粥樣硬化的核心基因是AKT1、FOS、IL6、JUN、VEGFA、CAT、CASP3、MMP9、PTGS2、CXCL8、ESR1、RELA、CYCS、AR、MMP2、CASP8、CDKN1A、HIF1A、CASP9、PGR。

2.4 GO富集分析GO富集分析分為分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)和細胞組成(cellular component，CC)三個部分。其中MF富集結果中排名前10的有過氧化物酶活性、G蛋白偶聯胺受體活性、抗氧化活性等(圖4A)；BP富集結果中排名前10的有對脂多糖的應答、對細菌起源分子的應答、對類固醇激素的應答等(圖4B)；CC富集結果中排名前10的有膜筏、膜微域、突觸前膜的整體成分等(圖4C)。

圖2 蛋白相互作用的PPI網絡

注：橫坐標：連接的節點數目；縱坐標：靶基因圖3 中藥-疾病核心靶基因柱狀圖

A：MF分析；B：BP分析；C：CC分析圖4 赤芍治療動脈粥樣硬化的網絡GO富集分析

2.5 KEGG通路分析KEGG通路分析共得到130條信號通路(圖5為Toll樣受體信號通路)，根據校正后的P值進行排序，排名前20信號通路的P值及基因比率制成氣泡圖(圖6)。結果顯示赤芍主要通過參與乙型病毒性肝炎、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、Toll樣受體信號通路等。

圖5 Toll樣受體信號通路圖

圖6 KEGG通路分析氣泡圖

3 討論

本文對赤芍治療冠狀動脈粥樣硬化的作用機制進行了網絡藥理學研究。中藥調控網絡顯示，赤芍參與治療動脈粥樣硬化的有效成分是ellagic acid(鞣花酸)、paeoniflorin(芍藥苷)、baicalein(黃芩素)、beta-sitosterol(β-谷甾醇)、sitosterol(谷甾醇)、Spinasterol(菠菜甾醇)、Stigmasterol(豆甾醇)、(+)-catechin(兒茶素)等12種。鞣花酸作為一種有效的抗動脈粥樣硬化成分，可阻止促炎細胞因子的表達。當內皮細胞受到氧化型低密度脂蛋白(low densitylipid protein cholesterl，LDL-C)或白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)攻擊時，可減少細胞黏附分子的表達并阻止NF-κB途徑的激活[7-9]。研究發現，鞣花酸可減輕高脂血癥家兔的氧化應激和動脈粥樣硬化[10]；能改善高脂飲食小鼠的內皮功能障礙和動脈粥樣硬化[11]。赤芍總苷具有抗凝血、抗血小板聚集及改善血液流變學異常的作用[12]。芍藥苷通過阻斷p38、ERK1/2/MAPK和NF-κB信號通路，阻滯細胞周期、抑制LDL-C誘導的血管平滑肌細胞增殖和遷移、減少炎性細胞因子的產生、抑制泡沫細胞的形成，減輕血管炎癥[13]。黃芩素能抑制引起細胞凋亡的內皮炎癥和氧化應激來保護血管內皮免受LDL-C引起的內皮功能障礙[14-15]。通過對ApoE缺乏的小鼠的研究證明，β-谷甾醇、菜籽醇和豆甾醇的混合物對動脈粥樣硬化病變的發展、斑塊的形成、泡沫細胞的形成和血管內皮損傷具有保護作用[15]。Stella等[16]研究表明，β-谷甾醇通過降低多種黏附分子的表達來抑制腫瘤壞死因子-α誘導的單核細胞(U937細胞)和人主動脈內皮細胞(HAECs)的黏附，從而證明了β-谷甾醇具有顯著的抗動脈粥樣硬化的潛力。一項包括1 160名男性和2 780名女性的基于中國社區的橫斷面的研究觀察到植物甾醇攝入量與頸動脈內膜-中層厚度超聲測量之間呈反向關系的趨勢[17]。含有 β-谷甾醇和亞油酸乙酯的山藥提取物可顯著抑制動脈粥樣硬化病變的發展；這種抗動脈粥樣硬化作用與顯著降低內膜增厚、血漿總膽固醇、LDL-C和C-反應蛋白(CRP)水平有關[18]。

KEGG通路分析顯示主要信號通路有乙型病毒性肝炎、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、Toll樣受體信號通路、雌激素信號通路等。在對非活動期的乙肝病毒攜帶者的研究發現，血小板活化和動脈粥樣硬化血栓形成的風險相對增加[19]?；谌巳旱年犃醒芯匡@示，乙肝表面抗原陽性是頸動脈粥樣硬化的一個獨立于其他混雜危險因素的危險因素[20]。乙型肝炎與顱內動脈粥樣硬化性狹窄的關系的多因素Logistic回歸模型顯示，乙肝核心抗體陽性且乙肝表面抗原陰性模式與顱內動脈粥樣硬化性狹窄的風險增加有關[21]。AGE-RAGE信號是一個復雜而錯綜復雜的級聯反應，已多種疾病中進行了研究。人類血管平滑肌細胞的研究顯示，RAGE的激活增加了骨基質蛋白ALPmRNA表達，表明RAGE信號在血管鈣化中發揮了作用[22]。有研究發現，即使在非糖尿病動脈粥樣硬化疾病中也存在AGEs和炎性配體，但程度較小；在非糖尿病載脂蛋白E缺失的小鼠中測試了對RAGE缺失的影響時發現，即使在沒有糖尿病的情況下，RAGE缺失也能減少動脈粥樣硬化的病變面積和復雜性[23-24]。先天免疫系統的Toll樣受體(TLR)與動脈粥樣硬化病變的發生密切相關。Lundberg等[25]通過對TLR信號轉接子缺陷的高膽固醇血癥小鼠的研究，證明了敲除免疫細胞中的TRIF相關接頭分子(TRAM)或含TIR結構域的接頭誘導干擾素-β(TRIF)可減輕血管炎癥和保護動脈粥樣硬化。此外，發現TLR3是造血免疫細胞中的促動脈粥樣硬化受體。通過對LDL-C受體缺陷小鼠實驗發現，TLR4缺乏可減少動脈粥樣硬化，證明了TLR4是治療動脈粥樣硬化的潛在靶點[26]。對載脂蛋白E缺乏小鼠研究發現，刺激TLR7會導致急性血管損傷后內皮功能受損，并與促炎細胞因子的產生以及循環中內皮微粒和Sca1/Flk1陽性細胞的形成增加有關，而且長期使用TLR7的配體(R848)治療的載脂蛋白E缺乏小鼠表現出動脈粥樣硬化斑塊的增加和主動脈組織中活性氧水平的升高，TLR7的激活能進一步誘導人冠狀動脈內皮細胞凋亡和遷移受損[27]。Koulis等[28]證明TLR9在動脈粥樣硬化中有保護作用，認為調節CD4+T細胞的細胞數量和炎癥表型描述是其潛在的機制。已有研究證明雌激素可保護動脈粥樣硬化病變的形成，并支持絕經前狀態能為心臟提供保護的假設[29-30]。內皮細胞凋亡是動脈粥樣硬化斑塊進展的一個重要因素。雌激素可通過抑制ERK磷酸化來抑制內皮細胞凋亡來延緩動脈粥樣硬化進程[31]。有趣的是，雌激素對動脈粥樣硬化的影響在不同年齡階段是不同的。動脈粥樣硬化與一氧化氮的生物利用度和(或)活性的降低有關[32]。而Laura等[33]觀察到衰老改變了雌激素受體的表達比率和DNA甲基化水平對雌激素介導的一氧化氮生物利用度有不利影響，并提出其中一部分的機制是影響雌激素誘導一氧化氮合酶活性的上調和清除氧自由基的能力。

對動脈粥樣硬化的治療，中醫有獨特的優勢和特色的診療方法，同時中藥對于疾病的作用是多靶點且具有雙向調節的作用，故其作用機制非常復雜，需要進一步的探索。網絡藥理學就是探討藥物對疾病多靶點的影響作用，故本研究基于網絡藥理學對赤芍治療動脈粥樣硬化的作用機制進行了初步研究，為以后的研究提供了一定的參考價值，但由于網絡藥理學自身的局限性和中藥應用的復雜性，研究結果可能存在一定的偏差，仍需進一步臨床驗證。