加貝酯對腦缺血再灌注損傷大鼠的影響及機制研究

喬建新 劉熙鵬 劉 明 王靜輝 管超楠

1.河北北方學院附屬第一醫院神經外科，河北張家口 075000；2.河北北方學院附屬第一醫院核醫學科，河北張家口 075000

腦缺血再灌注損傷是指缺血性腦血管病患者通過溶栓、介入手術等手段實現血流灌注后出現的缺血區腦組織損傷進一步加重的現象，嚴重影響著該類患者的治療效果和生命健康，是臨床上亟待解決的醫學難題之一[1]。近年來，藥理學研究發現許多合成或天然物質的神經保護劑經過實驗研究，證明具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，但是由于動物與人類生理機制及耐受性等方面的差異以及腦缺血后級聯反應的復雜性，單一阻斷某一病理環節的藥物可能難以奏效，多數神經保護劑未能在臨床得到廣泛應用，出現臨床和理論的嚴重脫節。所以在目前的臨床治療中，理想的神經保護劑應該具備針對缺血再灌注損傷多個損傷環節發揮保護作用的特性[2-3]。加貝酯作為一種非肽類蛋白水解酶抑制劑，近年來在改善缺血方面的作用備受關注[4]。本研究重點探討加貝酯是否對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的保護作用并探討其機制，形成科研成果，為加貝酯應用于腦缺血再灌注損傷的臨床治療提供臨床前研究數據，為腦缺血再灌注損傷的治療提供新的治療方案，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取河北北方學院動物實驗室125 只實驗用清潔級雄性SD 大鼠，鼠齡7 周，體質量200～2420 g，清潔級，室溫環境飼養，自由進食水，由乾元浩生物股份有限公司提供。動物許可證號：SCXK（豫）2018-0001。本研究已通過河北北方學院附屬第一醫院倫理委員會的審核并得到批準［批準號（科）倫審第〔2019〕107 號］。

1.1.2 藥品與試劑 加貝酯（常州四藥制藥有限公司，規格：0.1 g，批號：201936854）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購自碧云天生物技術研究所（批號：2013685），Tunel 檢測試劑盒購自上海滬震實業有限公司（批號：2015227）；丙二醛（MDA）水平采用酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測試劑盒美國CST（批號：2018429）；相關基因[B 細胞淋巴瘤因子2（bcl-2）mRNA、水溶性相關蛋白（Bax）mRNA] 表達及相關蛋白[半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、核因子κB（NF-κB）] 試劑盒均購自美國Sigma-Aldrich 公司（批號：2016594）。

1.1.3 儀器 BX53M 光學顯微鏡購自日本Olympus 公司；Mini-Sub 電泳儀購自美國Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 模型構建 選取125 只實驗用清潔級雄性SD 大鼠采用改良線栓法制備局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，制備流程：2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉沙土鼠，5～10 min 后將動物固定于手術臺上，沿腹部頸中線開一口，分離兩側腺體及頸肌，暴露氣管及左右兩頸動脈，將頸動脈與神經分離，穿線備用，雙側同時進行無創微動脈夾夾閉5 min，然后松開血夾恢復血流，再灌注72 h。

1.2.2 動物分組及給藥方法 將大鼠按照隨機數字表法分為假手術組、模型組、加貝酯高中低劑量組，每組25 只，其中加貝酯低、中、高劑量組分別經腹腔注射加貝酯25、50、75 mg 進行干預治療。假手術組和模型組同步給予等體積生理鹽水。

1.2.3 觀察指標 治療滿療程后，行盲法神經功能評分[5]，取大鼠腦組織測定其含水量和梗死體積，石蠟包埋，切片處理后行HE 染色觀察大鼠腦組織病理形態學變化；行TUNEL 染色觀察大鼠神經細胞凋亡狀況；測定大鼠腦組織中抗氧化酶[超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）] 的活性并測定MDA 水平，測定大鼠腦組織中炎癥因子[腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）] 水平，測定大鼠腦組織凋亡相關基因（bcl-2 mRNA、Bax mRNA）表達及相關蛋白（Caspase-3、NF-κB）表達。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0 軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分和神經細胞凋亡率比較

模型組神經功能缺損評分低于假手術組，神經細胞凋亡率高于假手術組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。加貝酯中、高劑量組神經功能缺損評分高于加貝酯低劑量組，神經細胞凋亡率低于加貝酯低劑量組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。加貝酯高劑量組神經功能缺損評分高于加貝酯中劑量組，神經細胞凋亡率低于加貝酯中劑量組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。加貝酯低、中、高劑量組神經功能缺損評分高于模型組，神經細胞凋亡率低于模型組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分和神經細胞凋亡率比較（）

表1 各組大鼠神經功能缺損評分和神經細胞凋亡率比較（）

注：與模型組比較，aP ＜0.05；與加貝酯低劑量組比較，bP ＜0.05；與加貝酯中劑量組比較，cP ＜0.05

2.2 各組大鼠腦組織病理形態學變化

與假手術組比較，模型組神經細胞萎縮，胞質與胞核、核仁均縮小、模糊，合并大量炎癥細胞浸潤；與模型組比較，加貝酯低、中劑量組的仍有大量神經細胞萎縮，胞質與胞核、核仁均縮小、模糊，且存在一定炎癥細胞，但尚有小部分神經細胞功能正常；而加貝酯高劑量組僅有小部分神經細胞萎縮、模糊，大部分的神經細胞胞漿和細胞核正常，且炎癥細胞浸潤程度明顯降低。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理形態學變化（HE 染色，100×）

2.3 各組大鼠腦組織MDA 和抗氧化酶活性比較

模型組MDA、SOD、CAT 水平高于假手術組，GSHPx 水平低于假手術組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。加貝酯中、高劑量組MDA、SOD 水平高于加貝酯低劑量組，GSH-Px、CAT 水平低于加貝酯低劑量組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。加貝酯高劑量組MDA、SOD 水平高于加貝酯中劑量組，GSH-Px、CAT 水平低于加貝酯中劑量組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。加貝酯低、中、高劑量組MDA、SOD 水平高于模型組，CAT 水平低于模型組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。加貝酯低劑量組GSH-Px 水平高于模型組，加貝酯中、高劑量組GSHPx 水平低于模型組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表2。

2.4 各組大鼠腦組織炎癥因子水平比較

模型組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均高于假手術組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。加貝酯中、高劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于加貝酯低劑量組，加貝酯高劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于加貝酯中劑量組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。加貝酯低、中、高劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均低于模型組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表3。

2.5 各組大鼠腦組織凋亡相關基因和蛋白表達比較

模型組Bax mRNA、Caspase-3、核NF-κB 均高于假手術組，bcl-2 mRNA、質NF-κB 均低于假手術組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。加貝酯中、高劑量組Bax mRNA、Caspase-3、核NF-κB 均低于加貝酯低劑量組，bcl-2 mRNA、質NF-κB 均高于加貝酯低劑量組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。加貝酯高劑量組Bax mRNA、Caspase-3、核NF-κB 均低于加貝酯中劑量組，bcl-2 mRNA、質NF-κB 均高于加貝酯中劑量組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。加貝酯低、中、高劑量組bcl-2 mRNA、質NF-κB 均高于模型組，Bax mRNA、Caspase-3、核NF-κB 均低于模型組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表4。

表2 各組大鼠腦組織MDA 和抗氧化酶活性比較（）

表2 各組大鼠腦組織MDA 和抗氧化酶活性比較（）

注：與模型組比較，aP ＜0.05；與加貝酯低劑量組比較，bP ＜0.05；與加貝酯中劑量組比較，cP ＜0.05。MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；GSHPx：谷胱甘肽過氧化物酶；CAT：過氧化氫酶

表3 各組大鼠腦組織炎癥因子水平比較（）

表3 各組大鼠腦組織炎癥因子水平比較（）

注：與模型組比較，aP ＜0.05；與加貝酯低劑量組比較，bP ＜0.05；與加貝酯中劑量組比較，cP ＜0.05。TNF-α：腫瘤壞死因子α；IL-1β：白細胞介素1β；IL-6：白細胞介素6

3 討論

隨著生活水平的提高、飲食結構的改變以及勞動強度的降低，尤其是高血壓、高血脂、糖尿病、動脈粥樣硬化等基礎疾病患病人數的增多，腦血管病發病率逐年升高，尤其隨著我國人口老齡化的加劇，我國腦血管病致死率已躍居疾病譜首位[6-7]。根據最新的流行病學資料顯示[8]，在我國每年新發生的250 萬例腦血管病患者中，河北省是腦血管病發病大省。腦血管病分出血性和缺血性腦血管病兩大類，其中缺血性腦血管病最為普遍（約占75%），缺血性腦血管病造成的死亡率僅次于心臟疾病，在我國國民的死亡原因統計中腦血管病已位列第2 位[9-10]。腦缺血梗死后可引起的認知功能障礙、血管性癡呆等并發癥，存活者中約2/3致殘，且5 年復發率高達41%，嚴重影響患者的生活質量，已逐漸發展成為危害人類生命健康的主要疾病之一，給患者家庭和社會帶來沉重的負擔，且近年來逐漸有年輕化的趨勢[11-12]。

腦組織發生缺血后及時通過溶栓、介入手術等治療手段恢復血供，挽救缺血半暗帶區的神經細胞是治療目的，也是目前臨床上在缺血性腦血管病康復治療中的首選治療手段[13-14]。未接受溶栓治療者腦組織中若腦血管出現自然再通有可能引起過度再灌注，而接受溶栓治療者血管再通可達到部分有效再灌注，但部分患者在實現血流再灌注后不僅沒有使組織功能恢復，反而使缺血所致的功能障礙和腦組織結構破壞進一步加重，即腦缺血再灌注損傷[15]。其主要由于微血管結構與功能完整性出現損傷，血腦屏障破壞、自身調節衰竭，同樣可能發生瀑布式神經損傷級聯反應所造成[3]。缺血再灌注并發癥的存在嚴重影響缺血性腦血管病患者的預后，因此以抑制缺血再灌注損傷為切入點，研究降低腦缺血再灌注并發癥損傷的藥物及治療方法，對于臨床上解決腦缺血再灌注損傷具有積極推動意義[16-17]。缺血性腦血管病包括局灶性腦缺血和全腦缺血兩種類型，以前者較為多見，多由腦血管栓塞所致，因此本研究選擇局灶性腦缺血為研究疾病。而加貝酯是一種非肽類蛋白水解酶抑制劑，可抑制胰蛋白酶、激肽釋放酶、纖維蛋白溶酶、凝血酶等蛋白酶的活性，從而制止這些酶所造成的病理生理變化，是臨床上急性輕型（水腫型）胰腺炎的常用藥物[18-19]。近年來藥理學研究發現[20-21]，加貝酯對肝臟、小腸、肺組織缺血再灌注損傷動物模型均具有一定的保護作用，具有良好的開發前景和廣泛的臨床應用價值，本研究結果發現，采用加貝酯的大鼠神經功能缺損評分升高，神經細胞凋亡率降低，腦組織病理損傷改善，提示加貝酯可降低神經損傷，對腦缺血后腦損傷有保護作用[22-23]。另外調查大鼠腦組織抗氧化酶活性及脂質氧化含量、炎癥因子、凋亡相關基因和蛋白的研究發現，采用加貝酯的大鼠MDA、SOD、GSH-Px 均顯著升高，TNF-α、IL-1β、IL-6、CAT 均顯著降低，Bax mRNA、Caspase-3、核NF-κB 均顯著降低，bcl-2 mRNA、質NF-κB 均顯著升高。由于細胞凋亡是腦缺血疾病細胞死亡的主要原因[24]，而本研究提示，加貝酯能抑制Caspase-3 凋亡通路激活，同時能抑制NF-κB 通路對缺血后腦損傷起保護作用。

表4 各組大鼠腦組織凋亡相關基因和蛋白表達比較（）

表4 各組大鼠腦組織凋亡相關基因和蛋白表達比較（）

注：與模型組比較，aP ＜0.05；與加貝酯低劑量組比較，bP ＜0.05；與加貝酯中劑量組比較，cP ＜0.05。Caspase-3：半胱氨酸蛋白酶3；bcl-2：B 細胞淋巴瘤因子2；Bax：水溶性相關蛋白；NF-κB：核因子κB

綜上所述，加貝酯能有效減輕大鼠腦缺血再灌注所致的病理損傷程度，能夠抑制再灌注后脂質氧化反應，發揮保護作用，同時能夠減輕炎癥反應導致的損傷，而以上作用可能是通過抑制NF-κB 信號通路，提高抗氧化酶活性，以降低腦組織炎癥損傷及神經細胞調亡所致。