乳腺癌組織中miR-155、HER-3 的表達及臨床意義

紀曉楠 李 勇 李恩杰

遼寧省本溪市中心醫院普外科，遼寧本溪 117000

乳腺癌是最常見的危害女性健康的惡性腫瘤之一，其發病率占人類所有惡性腫瘤發病率的7%～10%，并且其發病率呈逐年上升趨勢[1]。乳腺癌早期臨床癥狀不典型，因此，部分患者發現時已是晚期，并伴隨淋巴結轉移，情況不容樂觀。微小RNA（miRNA）是一種內源性單鏈非編碼RNA，長度為19～24 個核苷酸[2]。miRNA 可以與靶基因的3’UTR 區以不完全互補的方式結合，發揮其生物學作用，如抑制蛋白質翻譯等[3]。研究發現[4]，miRNA-155（miR-155）在多種腫瘤細胞中均呈高表達狀態，如胃癌、結腸癌等，并且其參與癌細胞的發生發展。潘虹等[3]認為，miR-155 可能在乳腺癌細胞的增殖、分化過程中發揮了重要作用。人類表皮生長因子受體（HER）家族，包括HER-1、HER-2、HER-3 和HER-4。目前，HER-2 已經成為乳腺癌治療的靶點[5]。HER-3 也具有多重生物學功能，如參與細胞增殖及分化過程。有研究顯示[6]，HER-3可以促進某些腫瘤生長，進一步加重腫瘤的惡性程度，如肺癌、胃癌。miR-155 與HER-3 在乳腺癌細胞中均呈高表達，但兩者在乳腺癌中的具體作用機制還不明確。本研究通過檢測miR-155 與HER-3 在乳腺癌中的表達并分析與臨床資料之間的關系，探究兩者在乳腺癌發生發展過程中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年3 月—2019 年8 月遼寧省本溪市中心醫院（以下簡稱“我院”）收治的乳腺癌患者87 例為研究對象。納入標準：①經活檢病理或術中病理檢查確診為乳腺癌；②首次診斷乳腺癌，且從未接受過任何抗腫瘤治療；③臨床病理治療完整，且簽署知情同意書。排除標準：①患有其他系統惡性腫瘤，如肺癌、胃癌等；②患有免疫功能缺陷。患者均為女性；年齡36～66 歲，平均（50.4±3.72）歲；≥50 歲53 例，＜50 歲34 例；腫瘤分化程度：中低分化49 例，高分化38 例；TNM 分期：Ⅰ期30 例，Ⅱ期23 例，Ⅲ期23 例，Ⅳ期11 例；有淋巴結轉移31 例，無淋巴結轉移56 例；腫瘤直徑＜2 cm 32 例，≥2 cm 55 例；月經初潮年齡＜13 歲42 例，≥13 歲45 例。本研究經我院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR 技術（qRT-PCR）檢測miR-155 的表達 收集活檢或術中獲取的乳腺癌組織及癌旁組織（距離腫瘤邊緣＞5 cm），冷凍保存并立即送檢。取100 mg 組織標本，應用Trizol 法提取總RNA（試劑盒購自美國Thermo 公司，生產批號：20160217），使用紫外分光光度儀檢測RNA 濃度，符合標準的RNA凍存備用。使用RNA 逆轉錄試劑盒（德國QIAGEN 公司，生產批號：20160211）將提取出的RNA 反轉錄為cDNA，U6 作內部參考。反應條件為37℃60 min，95℃5 min。反應體系為：0.15 μL dNTP，1 μL 逆轉錄酶，1.5 μL 10×RT 緩沖液，0.188 μL RNase 抑制劑，1 μL RNA，3μL miR-155/U6 RT 引物和8.162 μL NFH2O。qPCR 反應條件為：94℃預變性5 min，再變性1 min，60℃45 s，72℃延伸40 個循環，最后72℃再延伸10 min。反應體系為：10 μL 2×SYBR Green，1 μL 20×TaqDNA聚合酶，1.33 μL miR-155/U6 RT 產物和7.67 μL H2O。引物序列：miR-155，F：5’-AACTTGTAAACTCCCTCGACTG-3’，R：5’-CCTTACGTGACCTGGAGTCG-3’；U6，F：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，R：5’-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3’；GAPDH，F：5’ -CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC -3’，R：5’ -ATC CG-TTGACTCCGACCTTCAC-3’。每個樣本至少重復3 次，最后采集熒光信號，結果以2-ΔΔCt來計算和標準化miR-155 的相對表達量。

1.2.2 免疫組化檢測HER-3 蛋白的表達情況 將獲取的乳腺癌及癌旁組織甲醛固定并經石蠟包埋后，使用切片機切成厚度為5 μm 的切片，依次經過二甲苯脫蠟、無水乙醇梯度水化及PBS 清洗。再將切片浸泡在枸櫞酸緩沖液中，100℃加熱10 min 室溫冷卻，PBS 清洗。使用3% H2O2室溫孵育切片10 min，滴加一抗（美國ABCam 公司，生產批號：20160112），室溫孵育1 h，清洗后滴加二抗（北京ZSGB-BIO 公司，生產批號：20160202），室溫孵育0.5 h，DAB 顯色5 min，蘇木精復染3 min，乙醇再次梯度水化，最后樹脂封片。由專業病理醫師顯微鏡鏡檢（200×），選取20 個視野，計算每個視野的陽性細胞百分數，0～5%記0 分，＞5%～25%記1 分，＞25%～50%記2 分，＞50%～100%記3 分；按細胞染色強度，未著色0 分，淺黃色1 分，棕黃色2 分，黃褐色3 分。將以上兩項得分結果相乘[6]，0～2 分為陰性，3～5 分為+，6～8 分為++，9 分為+++。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數資料用例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性采用Spearman 相關分析。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組織與癌旁組織中miR-155 與HER-3 的表達情況

乳腺癌組織中miR-155 的相對表達量分別為（0.452±0.083），高于癌旁組織的（0.125±0.026），差異有高度統計學意義（t=35.067，P ＜0.001），見圖1。乳腺癌組織中HER-3 的陽性表達率為70.11%（61/87），高于癌旁組織的31.03%（27/87），差異有高度統計學意義（χ2=26.578，P ＜0.001），細胞染色結果見圖2（封四）。

圖1 乳腺癌組織及癌旁組織miR-155 電泳圖

2.2 乳腺癌組織中miR-155 和HER-3 的表達與患者臨床資料之間的關系

不同腫瘤細胞分化程度、TNM 分期及有無淋巴結轉移的乳腺癌組織中miR-155、HER-3 表達比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

2.3 乳腺癌組織miR-155 與HER-3 的表達相關性分析

Spearman 相關分析結果顯示，miR-155 與HER-3的表達呈正相關（r=0.576，P ＜0.05）。

3 討論

乳腺癌是引起女性死亡的第二大惡性腫瘤[7]。近年來，隨著醫療水平進步飛快，部分乳腺癌患者可以實現早診斷、早治療，提高了患者的生存率。但是，現有的乳腺癌生物標志物的診斷性能仍然存在缺陷，比如癌胚抗原，雖然廣泛應用于乳腺癌的監測，但其敏感性較低[8]。因此，積極尋找有效的乳腺癌生物學指標對于乳腺癌的診斷及治療有著重要的意義。

表1 乳腺癌組織中miR-155 與HER-3 的表達與患者臨床資料之間的關系

miRNA 是一種短鏈且單鏈的RNA，是各種細胞增殖分化過程中的重要的調節因子[9]。有研究顯示[10]，某些miRNA 可以調節細胞增殖和凋亡過程，可能會促進癌癥的惡性程度。miR-155 是一種致癌基因，在多種腫瘤細胞中均有表達。Liu 等[11]認為，乳腺癌中miR-155 的表達水平是正常乳腺組織中的5 倍。這與本研究結果有相同之處。本研究結果顯示，乳腺癌組織中miR-155 的表達水平高于癌旁組織（P ＜0.05）。其原因可能為miR-155 上調其靶基因HDAC2 的表達，而后者可以抑制酪氨酸激酶受體2（ErbB2）轉錄，ErbB2 可以抑制癌細胞的生長，miR-155 的高表達使機體實現代償性地抑制腫瘤細胞增殖和惡性進展的作用[12]。本研究結果顯示，不同腫瘤細胞分化程度、TNM 分期及有無淋巴結轉移的乳腺癌組織中miR-155 表達比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）。JAKSTAT 是最重要的信號傳導途徑之一，而miR-155 可以下調SOCS1 表達并激活JAK-STAT 信號通路，使其與某些與腫瘤相關的炎癥因子如白細胞介素-6、脂多糖等表達增加，促進了腫瘤細胞的增殖和分化過程[13]。基質金屬蛋白酶（MMP）16 屬于MMP 家族，是調節腫瘤遷移和侵襲的重要細胞因子。有研究發現[14]，MMP16 除了參與正常的生理過程外，還參與腫瘤的發生發展，例如胚胎發育和組織重塑。miR-155通過上調MMP16 的表達，促進乳腺癌細胞的遷移及轉移過程。FOX3a 是miR-155 的靶基因，FOX3a 可以誘導細胞凋亡過程，當miR-155 抑制FOX3a 的表達時，間接抑制了腫瘤細胞凋亡的過程，使得腫瘤惡性程度增高，TNM 分期升高[15]。

HER-3 是HER 家族的一員，其染色體位置為12q13。HER-3 由跨膜區、胞內區和胞外區組成[16]。通常情況下，HER-3 需要與家族中其他成員結合形成二聚體才能發揮其自身作用。有文獻報道[17]，HER-3可以與磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）結合，激活下游信號通路，調節細胞增殖、黏附及遷襲。高表達狀態的HER-3 可以促進腫瘤的發生發展，甚至可以調節腫瘤細胞地侵襲和轉移。本研究結果顯示，乳腺癌組織中HER-3 的表達水平高于癌旁組織（P ＜0.05）。其原因可能為HER-3 與家族成員HER-2 結合后，與PI3K 結合并激活下游信號通路，促進癌細胞的生長、分化等過程[18]。本研究結果顯示，不同腫瘤細胞分化程度、TNM 分期及有無淋巴結轉移的乳腺癌組織中HER-3 表達比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）。機制可能為HER-3 可以抑制血管生成素-1 與血管內皮生長因子的表達，使得腫瘤生長分化功能降低，進一步使腫瘤分化等級降低，腫瘤惡性程度增高[19-20]。HER-3 的過表達，激活了Ras/Raf/MAPK 信號轉導通路，當信息傳導至細胞核內，使得基因轉錄增加，加快了上皮間質轉化過程，促進了腫瘤細胞的浸潤與轉移過程[21]。HER-3 表達陽性的腫瘤細胞生長周期加快，腫瘤細胞更容易發生擴散及轉移，并使上皮細胞運動能力增強，使得腫瘤細胞逃離原病灶，轉移至其他組織中，進一步使得TNM 分期升高[22]。本研究結果顯示，miR-155 與HER-3 的表達呈正相關（r=0.576，P ＜0.05），miR-155 的表達水平會隨著HER-3 蛋白表達的升高而升高，提示兩者在乳腺癌的發生發展中發揮協同作用，共同促進腫瘤細胞的增殖、分化及浸潤的過程，但兩者具體協同作用機制目前依然未能確切，有待后續增加大樣本量繼續探究。

綜上所述，乳腺癌組織中miR-155 與HER-3 的表達與腫瘤TNM 分期、分化程度及淋巴結轉移有關，有望在乳腺癌的診斷及治療過程中提供可靠的科學依據。但兩指標在乳腺癌發生過程中的具體作用機制還需要多中心的研究進一步探討。