胃癌中DNA甲基化對miR-200c 141表達組分析

張睿 張郭亮 王飛娟

(銅川市人民醫院，1.腫瘤科;2.重癥科,陜西 銅川 727000)

miRNA在腫瘤因子的萌芽、發展以及轉歸的過程中起著巨大的作用，為醫學界對腫瘤的研究提供了新思路、新方向[1-2]。竇維佳等[3]研究中表明miR-200c與miR-141在結腸癌組織中具有增加癌細胞侵襲轉移能力的作用。近年來，隨著科技的迅速發展，對于腫瘤疾病的靶基因預測數據庫的更新換代速度也在逐步加快，腫瘤疾病的研究也在不斷深入[4]。然而，目前醫學界仍尚未明確miR-NAs自身的調控機制[5]。近期有學者在研究中指出，DNA甲基化通過調節miR-200 c以及miR-141的水平對于一些腫瘤因子和正常細胞的表達起著重要的作用，但是在胃癌中表達的調控機制上不明確[6]。鑒于此，本次研究旨在為臨床研究miR-200 c/141在胃癌中表達的調控機制提供參考依據。報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取我院2018年2月至2019年2月收治的58例胃癌患者納入至本次調研中，所有患者均接受胃癌根治術治療，且術前為接受任何放化療或新輔助治療。收集患者非壞死部分的腫瘤組織以及距腫瘤組織5 cm以上的癌旁組織作為檢測標本，樣本收集完成后全部放置在凍存管中進行保存。收集患者的相關病例資料，在收集的過程中發現有1例患者的數據資料遺漏，58例患者中男性45例，女性12例；年齡42～76歲，平均(54.73±2.56)歲。

1.2檢測所用試劑 Trizol試劑、GoTaq? Hot Start Green Master Mix、GoTaq? qPCR Master Mix以及逆轉錄試劑盒均來自于上海玉博生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1PCR擴增 實驗室檢驗人員按照GoTaq? Hot Start Green Master Mix的說明書進行操作，將通過亞硫酸鹽處理后的DNA作為試驗模板，進行PCR反應檢測。檢驗結果顯示miR-200 c/141-M(miR-200 c/141甲基化引物)上游引物為：5′-GTAAATCGGTGTGTGTCGCGGGTCG-3′；下游引物為：5′-CAAACCCTCCGAAACCCCTCGACCG-3′。miR-200 c/141-UM(miR-200 c/141非甲基化引物)上游引物為：5′-GTAAATTGGTGTGTGTTGTGGGTTG-3′；下游引物為5′-CAAACCCTCCAAAACCCCTCAACCA-3′。所有檢測標本皆設置為空白對照，采用2.0%瓊脂糖凝膠將PCR擴增產物進行電泳，觀察軟件掃描結果，判斷甲基化率。

1.3.2實時熒光定量PCR 利用Trizol試劑提取胃癌組織或癌細胞中的RNA，并進行相關檢測，利用逆轉錄試劑盒將miRNA或mRNA反轉錄為cDNA。然后根據GoTaq? qPCR Master Mix說明書中所提供的內容調配反應溶劑，然后根據PCR反應溶劑檢測情況判斷檢測結果。檢測中應用到的特異引物為：hsa-miR-200 c-RT：GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGATCCATC；hsa-miR-200 c-Forward：GGCCTAATACTGCCGGGTAAT；hsa-miR-141-RT：GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCATCT；hsa-miR-141-Forward：CCCGGGTAACACTGTCTGGTAA。

1.4觀察指標 (1)觀察并分析miR-200 c以及miR-141在胃癌組織中的表達水平情況；(2)統計所有胃癌患者標本中miR-200 c/141CpG島的甲基化水平；(3)分析miR-200 c/141CpG島的甲基化水平與miR-200 c以及miR-141之間的關系。

1.5統計學方法 采用SPSS21.0分析，計數資料miR-200 c以及miR-141在胃癌組織中的表達水平、所有胃癌患者標本中miR-200 c/141CpG島的甲基化水平，經χ2檢驗，以%表示，差異有統計學意義為P<0.05。

2 結 果

2.1miR-200 c以及miR-141在胃癌組織中的表達水平情況對比 58例胃癌患者標本中(1例數據資料遺漏)，miR-200 c和miR-141的表達下調例數分別是44例、42例，占比為77.19%、73.68%，通過觀察可知，較之于癌旁組織標本，胃癌組織中的miR-200 c和miR-141的表達有明顯下降(P<0.05)。見圖1。

圖1 miR-200 c以及miR-141在胃癌組織中的表達水平情況對比

2.2所有胃癌患者標本中miR-200 c/141CpG島的甲基化水平情況對比 58例胃癌患者標本中(1例數據資料遺漏)，miR-200 c/141CpG島的甲基化水平上升的例數為47例，占比為82.46%；通過觀察可知，較之于癌旁組織標本，胃癌組織中的miR-200 c/141CpG島的甲基化水平有明顯上升(P<0.05)。見圖2。

圖2 所有胃癌患者標本中miR-200 c/141CpG島的甲基化水平情況對比

2.3miR-200 c/141CpG島的甲基化水平與miR-200 c以及miR-141之間的關系 miR-200 c/141CpG島的甲基化水平與miR-200 c/141表達水平為負相關關系。

3 討 論

胃癌是臨床上常見的消化道腫瘤，具有高發病率、高死亡率等特點[7]。近年來我國胃腸疾病患者的數量不斷增加[8]。胃癌是胃腸疾病病變的終極表現，也是最有可能導致人體死亡的疾病，此外有研究表明胃癌手術有可能因手術時間長、感染等因素誘發重癥肺炎、重癥腹腔感染，且入住重癥監護室(ICU)后還有較高風險發生ICU綜合征，嚴重影響了患者的生命安全[9]。根據世界衛生組織(WTO)的調查結果顯示，東亞地區是全球胃癌疾病的高發區域，其中我國胃癌病死率接近與全球胃癌死亡人口的五分之二[10-11]。因此，如何改善胃癌患者的治療環境，降低胃癌患者的病死率成為我國乃至全球醫學界需要重點研究的問題[12]。近幾十年來，醫學界的工作人員通過不斷研究，發現了miRNAs在腫瘤的生長和發展過程中起著中要的作用，能有效抑制腫瘤因子的成長[13]。

作為一種小分子非編碼RNA，miRNAs其種類多樣，其中最常見的是miR-200，而miR-200 c、miR-141是miR-200組合中的重要組成部分，其主要分布在人體的第12常染色體上[14]。本次研究結果表明miR-200 c與miR-141在胃癌組織中的表達有明顯的下降，這與李鷹飛等[15]研究報告中所述基本一致。這說明在胃癌疾病的生長發展過程中，miR-200 c與miR-141發揮著重要的作用，臨床醫生與學者可將miR-200 c與miR-141作為生物靶點，為患者提供有效的抗腫瘤治療方案[16-17]。

隨著醫學界對miRNAs的深入研究中發現，人類miRNAs基因主要分布在染色體易位或染色體缺失的位置，且遺傳學因素是影響miRNAs的重要因素，其中DNA甲基化是主要影響因素[18]。本次研究結果表明胃癌組織中的miR-200 c/141CpG島的甲基化水平有明顯上升，miR-200 c/141CpG島的甲基化水平與miR-200 c/141表達水平為負相關關系，這與周欣亮等[19]人研究報告中所述基本一致。

BS-MSP方法是比較新穎的基因甲基化檢測模式，具有耗時較短、檢測速度快、實用性強、靈敏度高、特異性強等優點，可快速檢測出CpG位點中甲基化的狀況，在研究腫瘤相關表達調控機制中具有極大的現實意義，能夠較好的獲取CpG島中的相關遺傳學信息，使研究者可明確DNA甲基化在miR-200 c與miR-141中的作用[20-21]。

綜上所述，在胃癌組織中，miR-200 c以及miR-141的水平隨著miR-200 c/141CpG島的甲基化水平的升高而降低。同時BS-MSP方法有利于研究者從分子水平領域探究胃癌疾病發展的病因，為臨床診治胃癌疾病提供依據和方向，可在臨床中推廣和廣泛使用。