生物基高分子材料尼龍5單體5-氨基戊酸生物合成研究進展

羅 洲，崔華偉，涂文應，曹瑞琪，李 強，茍興華，程 杰

(成都大學/農業農村部雜糧加工重點實驗室，四川，成都，610106)

1 5-氨基戊酸概述

5-氨基戊酸(5AVA)，英文名稱為5-Aminovaleric acid，分子式為C5H11NO2，分子量為117.15。5AVA溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚和苯。5AVA有1個氨基和1個羧基。其化學結構如圖1所示。5AVA是一種生產尼龍5和尼龍6,5的潛在原料，也能用于合成戊二酸、δ-戊內酰胺、1,5戊二醇和5-羥基戊酸等C5平臺化學品。目前工業上制備5AVA主要使用化學法。一般采用戊內酰胺或戊內酰胺聚合物水解后精制而得。這些方法與生物法相比反應條件苛刻，能耗大，設備腐蝕大，效率低，分離復雜。因此開發生物基來源的5AVA生物合成路線具有重要的現實意義。5AVA可用于合成新型人造纖維尼龍5等重要工程塑料，廣泛應用于化工、輕紡等工業。2016年，全球聚酰胺的市場約為240億美元，預計到2022年，市場需求將超過300億美元，平均年增長率將超過5.5%。近年來隨著合成生物學的快速發展，氨基酸產業在成本與產量上均取得了巨大突破。微生物發酵生產天然氨基酸的成本持續降低，全球氨基酸產量預計到2022年將突破1100萬t。我國作為氨基酸生產和消費大國，大宗型氨基酸產品已處于供過于求的狀態。隨著L-賴氨酸合成工藝的成熟和生產成本的降低，其產能嚴重過剩，導致市場售價大幅降低。目前賴氨酸鹽酸鹽的市場價格約為1700美元/t，而5AVA約為37萬美元/t，具有顯著的經濟效益。因此，發展使用生物基L-賴氨酸作為初始原料生產高附加值產品的新型生物技術，具有重要的經濟意義和社會價值。

圖1 5AVA的化學結構

2 微生物中5-氨基戊酸的生物合成路徑

越來越多的環境污染、氣候變暖和能源短缺等問題正在促進可持續綠色的生物制造發展。利用微生物生產5AVA，可以減少對環境的污染，是符合國家和民族走可持續發展之路的新型制造方式。由于5AVA及其衍生物具有廣泛的應用前景，其合成已引起眾多國內外研究者的興趣，并開發出許多新的合成方法和技術。目前，5AVA的生物合成主要有4種途徑(圖2～圖5)。其中，5-氨基戊酰胺介導合成5-氨基戊酸途徑是最重要的途徑，在惡臭假單胞菌中，L-賴氨酸通過兩步酶催化反應轉化為5AVA。第二條途徑是戊二胺介導合成5AVA途徑，以L-賴氨酸為底物，通過三步酶催化反應轉化為5AVA。第三條途徑是2-酮-6-氨基己酸介導的賴氨酸α-氧化酶合成5-氨基戊酸途徑，以L-賴氨酸為底物，經過一步酶催化轉化為中間體2-酮-6-氨基己酸，中間體在過氧化氫的作用下，自動脫羧氧化為5AVA。最后一條途徑是2-酮-6-氨基己酸介導的多基因合成5-氨基戊酸途徑，這是一條非天然合成途徑。

2.1 5-氨基戊酰胺介導合成5-氨基戊酸途徑

5AVA的天然合成途徑是在惡臭假單胞菌中發現的，其合成途徑見圖2。首先，L-賴氨酸被L-賴氨酸2-單加氧酶(DavB)氧化脫羧為5-氨基戊酰胺。然后，5-氨基戊酰胺被δ-氨基戊酰胺酶(DavA)水解為5AVA。Liu等[1]將DavB和DavA進行分離純化，利用生物酶法生產了20.8 g/L 5AVA，得率為0.69 g/g 賴氨酸。Wang等[2]利用全細胞催化技術，優化誘導時間、反應溫度、反應時間和金屬離子等，最終獲得了240.7 g/L 5AVA，這是目前世界上報道的最高產量。Li等[3]過量表達賴氨酸轉運蛋白LysP和4-氨基丁酸轉運蛋白PP2911，進一步強化了5AVA的轉運。Joo等[4]利用芒草水解液，成功制備了12.51 g/L 5AVA。

圖2 5-氨基戊酸生物合成途徑一

2.2 戊二胺介導合成5-氨基戊酸途徑

Rohles等[5]建立了生產C5平臺化學品5AVA 與戊二胺的耦合生產工藝，合成途徑見圖3，最優菌株能生產28g/L5AVA，最大生產率為0.9g/L/h。Jorge等[6]建立了一種戊二胺介導的5AVA合成途徑，以戊二胺為中間體，賴氨酸脫羧酶(LdcC)、戊二胺轉氨酶(PatA)和γ-氨基丁醛脫氫酶(PatD)三步法合成5AVA的生物合成途徑，以葡萄糖胺、木糖和阿拉伯糖為替代碳源，生產了5.1g/L5AVA。

圖3 5-氨基戊酸生物合成途徑二

2.3 2-酮-6-氨基己酸介導單基因合成5-氨基戊酸途徑

Pukin等[7]利用來源于綠色木霉的L-賴氨酸α-氧化酶(LysOx)將L-賴氨酸的α-氨基氧化成羰基，同時產生NH3和 H2O2，生成的中間體2-酮-6氨基己酸在不添加過氧化氫酶的情況下自動氧化脫羧形成5AVA，利用固定化酶LysOx在37℃條件下反應5d后成功制備了13.4g/L5AVA。Cheng等[8]將日本鯖來源的L-賴氨酸α-氧化酶(RaiP)在大腸桿菌BL21(DE3)中過量表達，敲除賴氨酸降解基因cadA以減少底物消耗，建立L-賴氨酸α-氧化酶單基因表達的代謝工程菌株。添加4%乙醇和10mM H2O2能顯著提高5AVA的產量，最后在5-L發酵罐中生產了29.12g/L 5AVA，得率為0.44g/g賴氨酸。馬金蓮等[9]發現L-氨基酸氧化酶可以催化L-氨基酸的氨基生成相應酮酸，并且成功將來源于紅球菌的氨基酸氧化酶在大腸桿菌中表達，并首次用于生物催化合成5AVA。結果表明催化合成5AVA時，最適底物L-賴氨酸濃度為17mmol/L，最適pH為7.0，最適溫度為37℃，最適時間為24h，添加0.5% H2O2，最終5AVA產量達到16.71mmol/L。此研究成功實現了L-氨基酸氧化酶合成5AVA。

圖4 5-氨基戊酸生物合成途徑三

2.4 2-酮-6-氨基己酸介導多基因合成5-氨基戊酸途徑

Cheng等[10]首次建立了2-酮-6-氨基己酸介導的5AVA合成途徑。過量表達日本鯖來源的L-賴氨酸α-氧化酶(RaiP)、乳酸乳球菌來源的α-酮酸脫羧酶(KivD)和大腸桿菌來源的乙醛脫氫酶(PadA)，在大腸桿菌中實現L-賴氨酸到5AVA的生物合成。通過過量表達過氧化氫酶 KatE來分解RaiP產生的H2O2。利用同源性建模、分子對接和分子動力學模擬等方法識別突變位點，提出了一種可能的酶改造機制：突變體催化通道的擴大，更多氫鍵的形成，可能更有利于底物舒展。使用了四種策略來增加5AVA的生產。首先，賴氨酸脫羧酶基因cadA被敲除。第二，L-賴氨酸鹽酸鹽被用作底物。第三，H2O2可以抑制細胞生長，從而影響目標生產。因此通過過氧化氫酶KatE的表達，H2O2被分解，含量顯著降低。此外，賴氨酸轉運蛋白LysP 被過量表達，加強底物賴氨酸的轉運。最后通過分批補料生物轉化得到52.24g/L5AVA。

圖5 5-氨基戊酸生物合成途徑四

3 提高生物合成5-氨基戊酸產量的策略

培養基成分和培養條件對5AVA的生物合成有顯著影響。為提高5AVA生物合成的經濟性，研究人員對菌種選育、培養基成分優化、發酵條件優化和蛋白表達優化等策略進行了廣泛的研究。雖然惡臭假單胞菌具有天然的5AVA 合成途徑，但發酵過程通常很長，這增加了設備成本，進一步限制了工業化的可擴展性。因此，除了惡臭假單胞菌以外，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌合成5AVA也取得了重大突破。在工業發酵過程中，發酵培養基的成分對于代謝產物的產量和得率至關重要。

4 結語和展望

由于化學合成工藝的缺陷，生物合成5AVA受到越來越多的關注。雖然在機理認識和提高5AVA產量和得率方面取得了很大突破，但在經濟上仍不具備工業化的可行性。為了將實驗室研究成果轉化為工業過程，底盤菌種開發和生物過程優化之間的深度集成綜合開發是必要的。

綜上，生物合成5AVA的方法主要有生物酶法、發酵法和全細胞催化法，每種方法各有優缺點。目前有4種5AVA生物合成途徑。產量較高的是途徑一：5-氨基戊酰胺介導合成5-氨基戊酸途徑和途徑四：2-酮-6-氨基己酸介導的多基因合成5-氨基戊酸途徑，具有產業化前景。生物酶法需要進一步優化生物合成途徑，控制合成的關鍵步驟，定向進化合成關鍵酶，從而獲得高純度的5AVA；發酵法需要進一步改進發酵步驟，從而提高合成5AVA的效率；全細胞催化法需要進一步提高催化效率，提高細胞密度。目前這些方法都處在實驗室小試階段，還未進行中試和產業化，還有待進一步研究改進。5AVA是合成尼龍5和尼龍5,6的重要前體物質，如今工業生產5AVA污染比較大，并且生產效率不高，所以降低5AVA生產成本是可持續發展的重要研究方向，并且擁有巨大的發展前景。隨著生物科學技術的發展，生物法合成5AVA的研究也將不斷改進，從而降低生產成本，提高產量。

表1 5-氨基戊酸的生物合成