冠心病血漿外泌體中lncRNA 和circRNA 生物信息學分析

謝傳乙，伍巧源

（廣西醫科大學第一附屬醫院腎內科，廣西 南寧530021）

0 引言

冠心病包括穩定型心絞痛、不穩定型心絞痛、心肌梗死和心源性猝死[1]。冠心病是一種由血管和心肌功能紊亂引起的疾病，主要的病理過程包括缺血、缺氧、氧化應激、炎癥和細胞凋亡[2-4]。外泌體是直徑小于150nm 的細胞外囊泡，含有多種生物活性分子，如蛋白質、脂類和核酸（lncRNA、circRNA 等）。外泌體被認為在細胞通訊中起作用，與許多生理和病理功能有關[5-7]。其中，外泌體生物活性分子的多樣性使其成為非侵入性生物標記物的良好來源[8-10]。最近的研究發現，由于其對炎癥、血栓形成、新生血管生成、細胞存活和內皮細胞穩態的影響，外泌體可能在動脈粥樣硬化病變的發生和發展中起作用[11]。進一步的研究發現一些circRNA 與冠心病有關：在外周血中，一些circRNA 被鑒定為冠心病的生物標志物[12]。梁等人發現SOCS2-AS1 可能成為診斷冠心病的新的生物標志物[13]。此外，外泌體中lncRNA 也對CHD 有影響：CTA-384D8.35 和CTB-114C7.4 可以作為診斷冠心病生物標記物，并可作為潛在的治療靶點[14]。綜上所述，目前研究證實，lncRNA 和circRNA在冠心病發病機制中起重要作用。然而，關于lncRNA 和circRNA 共同作用于冠心病的類似研究仍較缺乏。

本研究通過生物信息學方法分析CHD 發生相關差異表達基因，構建起lncRNA、circRNA、miRNA 和 mRNA 之間的ceRNA 網絡，并結合GO 和KEGG 進行相關功能分析，為探索CHD 的發病機制提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 冠心病lncRNA、circRNA 和mRNA 差異表達分析

從exoRBase 下 載(http://www.exoRBase.org)[15]circRNA，lncRNA，mRNA 的表達譜。用T 檢驗進行差異表達分析。Log| Fold change|值＞0.5 且P＜0.05 為上調差異表達基因。用火山圖來顯示CHD 中顯著上調或下調的20 個差異表達基因。

1.2 ceRNA 調控網絡的構建

首先，采用Targetscanhuman7.2(http://www.targe-tscan.org/vert_72/)和 miRanda (http://www.microRNA.org/microRNA/home.do)預測調控DEmRNAs 的miRNAs, 將同時在兩個數據庫都被預測到的 mRNAs-miRNA 調控關系納入后續的分析中。隨后，利用ENCORI (http://starbase.sysu.edu.cn/) 預測調控DEcircRNAs 的miRNAs, 構建 circRNA-miRNA 關系對。miRcode 預測調控差異lncRNAs 的miRNAs。最后，以miRNA 為連接點，取circRNAs 和lncRNAs 預測的miRNAs 與mRNAs 預測的miRNAs 取交集，篩選出的基因用Cytoscape軟件構建ceRNA 網絡進行可視化(http://cytoscape.org/)。

1.3 GO 和KEGG 富集分析

提取ceRNA 網絡中的mRNA，使用http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/genelist/進行GO 和KEGG 分析并將結果使用網站http://www.bioinformatics.com.cn/login/進行繪圖。

2 結果

2.1 冠心病差異表達基因

32 例正常人和6 例冠心病患者的RNA 表達數據被納入本研究。其中差異表達的mRNA 52 個，差異表達的lncRNA 24 個，差異表達的circRNA 85 個。我們選擇了在CHD 和正常人中基因的上調和下調最為顯著的20 個差異表達的基因用R 語言繪制火山圖(圖 1a, b, c)。

2.2 ceRNAs 調控網絡的建立

通過網站與軟件預測并取交集之后，最終我們選擇 4 個 lncRNA(RPL9P7,ZNF322P1,FTH1P20,EEF1A 1P9), 5 circRNA(hsa_circ_0001020,hsa_circ_0000038,hsa_circ_0001309,hsa_circ_0001360,hsa_circ_0000019), 18 miRNA (hsa-miR-29c-3p,hsa-miR-15b-5p,hsa-miR-34a-5p,hsa-miR-449b-5p,hsa-miR-16-5p,hsa-miR-34c-5p,hsa-miR-145-5p,hsa-miR-29a-3p,hsa-miR-363-3p,hsa-miR-15a-5p,hsa-miR-27a-3p,hsa-miR-195-5p,hsa-miR-449a,hsa-miR-128-3p,hsa-miR-497-5p,hsa-miR-340-5p,hsa-miR-29b-3p,hsa-miR-424-5p)和5 mRNAs ( IFI30,RGPD5,RGPD6,HSPA1B, RGS3) 構 建lncRNA（circRNA） ——miRNA——mRNA 調 控ceRNA 網絡(圖 2)。

圖1 冠心病與正常人的差異表達基因

2.3 ceRNA 網絡中差異mRNAs 的細胞功能及通路分析：分析差異mRNA 生物

學過程和通路，得出10 個主要的生物學過程，與核糖核酸酶活性的調控，蛋白質穩定性調節，核酸內切酶活性，外源蛋白結合及小蛋白偶聯或去除對蛋白質修飾的負調控作用的生物學過程有關（圖3），此外有3 條主要的信號通路：MAPK通路(圖4）。

3 討論

近年來，用各種非編碼RNA 構建ceRNA 網絡來探討疾病的發病機制及治療靶點成為一大研究熱點，ceRNA 假說揭示了一種RNA 間相互作用的新機制[16]。miRNA 是轉錄后調控的重要因子之一，其活性可被circRNA、lncRNA 通過“海綿”吸附的方式調控ceRNA[17]。circRNA、lncRNA 競爭性地與miRNA 結合導致miRNA 的活性受到影響從而導致基因沉默，進而調節編碼基因的蛋白質水平，參與靶基因的表達調控。炎癥和氧化應激影響冠心病的機制。這項研究為外泌體影響冠心病的機制提供了一些見解。然而，我們沒有得到冠心病患者的生存時間，因此沒有進行生存分析。

圖2 ceRNA 調控網絡

4 結論

在本研究中，我們認為外泌體中的lncRNA 和circRNA可能通過抗炎和抗氧化影響冠心病的發生發展。

圖3 GO 富集通路

圖4 KEGG 富集通路

本研究通過下載exoRBase 數據庫中與冠心病外泌體RNA 表達譜，運用GO、KEGG 等生物信息學分析法分析靶點mRNA 的功能以期為CHD 發病機制及診治靶點研究提供理論依據。結果顯示：mRNA 主要與腫瘤壞死因子 介導的信號通路的調控和MAPK 信號通路有關。腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha, TNF-α) 被定義為動脈粥樣硬化的發病和進展的關鍵危險因子[18]。TNF-α 調節細胞因子網絡和粘附分子的表達，并激活多種信號轉導途徑，也被稱為心血管疾病的轉換器[19,20]。研究發現治療冠心病的作用機制之一可通過調節甘油磷脂代謝和亞油酸和亞麻酸代謝，抑制表皮生長因子受體的表達和激活MAPK 信號通路。從而影響炎癥相關(TNF- TNF-、IL-6、MMP9) 和氧化應激相關(ox-LDL、MDA、SOD)指標，起到抗氧化應激和抗炎作用[21]。這也與我們的研究一致。綜上所述，外泌體中的lncRNA 和circRNA 可能通過抗原提呈和MAPK 信號通路對