腸道益生菌補充對酒精高糖高脂致肝損傷大鼠肝功能和腸道菌群的影響

梁璇，張正，單妍，謝薇，顧龍龍

(昆明醫科大學海源學院基礎教學部生物化學暨分子生物學教研室,昆明 650106)

長期高糖、高脂飲食并攝入大量酒精會對肝臟產生不可逆的損傷[1]。黃亞等[2]研究表明：人腸道微生物種類超過1 000種，總數量超過1014，是人體細胞的10 倍。人的腸道菌群主要分為三類：益生菌(probiotics)、致病菌(pathogenic bacterium)、無害菌(harmless bacteria)。益生菌制劑是一種可以平衡腸道菌群生態，對宿主健康有益的活體微生物制劑。本文旨在研究腸道益生菌補充對酒精、高糖、高脂致肝損傷大鼠肝功能和腸道菌群的影響，以期了解腸道益生菌補充對酒精、高糖、高脂致肝損傷大鼠肝功能和腸道菌群保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級3周齡大鼠40只，體質量(200±20)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號:SCXK(京)2017-0022，普通級，分4個籠子飼養，每個籠子10只。飼養于本院動物中心實驗室。

1.2 藥物與試劑 益生菌(主要包含：嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌及乳雙歧桿菌，其含量為1×1011CFU/L)購自日本國養樂多株式會社；DAO、D-LA ELISA 檢測試劑盒購自上海迪奧生物科技有限公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α) 、白細胞介素6(IL-6)試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司；NF-κB抗體購自上海滬震實業有限公司；紅星牌二鍋頭白酒北京釀酒總廠出品，酒精度55%；乙醇檢測試劑盒購自北京智微科技有限公司。菌群檢測所用藥物及試劑。

1.3 儀器 低溫高速離心(德國Eppendorf公司產)，恒溫水浴箱(天津泰新特儀器公司產)，光學顯微鏡(美國Thermo公司產)，熒光分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司產)，全自動生化分析儀(日本日立公司產)，蛋白電泳及轉膜儀(美國Bio-Rad公司產)。全自動生化儀，以及WB所用儀器。

1.4 方法

1.4.1 建立模型 40 只大鼠隨機分為 4組，即空白對照組、模型組、低劑量腸道益生菌組和高劑量腸道益生菌組。空白照組喂普通飼料，其余各組以高糖高脂飼料[3](68%基礎飼料、10%蔗糖、10%蛋黃、10%豬油、1%膽固醇、1%膽鹽) 喂養，并每天使用紅星二鍋頭灌胃，灌胃濃度為：5 mL/kg，濃度每周遞增1 mL/kg，于第7周末造成大鼠 AFLD 模型。

1.4.2 分組及藥物干預 40 只大鼠隨機分為4組，即空白對照組、模型組、低劑量腸道益生菌組(簡稱低劑量組)和高劑量腸道益生菌組(簡稱高劑量組)。建立酒精、高糖、高脂致肝損傷大鼠模型后，低劑量腸道益生菌組使用益生菌灌胃劑量為：20×108CFU /kg，高劑量腸道益生菌組使用益生菌灌胃劑量為：40×108CFU /kg，模型組和空白對照組使用等量的0.9%氯化鈉注射溶液灌胃處理，每天灌胃1次，連續給藥28 d。

1.4.3 檢測項目

1.4.3.1 血清乙醇體積分數測定 干預第45天時，將各組大鼠用55%乙醇灌胃后分別在 0.5 h、1 h、2 h、3 h進行尾靜脈采血，每次采血量約為0.5 mL，使用低溫離心機在3 000 r/min、4 ℃條件下10 min得血清，按照EnzyChromTM乙醇檢測試劑盒說明書進行血清乙醇體積分數測定。

1.4.3.2 臟體比測量 干預7周后經股動脈采血后頸椎脫臼處死全部大鼠，離心得血清，迅速留取大鼠肝臟，并測量大鼠肝臟和完整盲腸并稱質量，分別計算大鼠的肝體比和盲體比。

1.4.3.3 血清生化指標測定 使用全自動生化儀檢測血清中丙氨酸轉氨酶(ALT) 、門冬氨酸轉氨酶(AST) 、堿性磷酸酶(AKP) 、三酰甘油(TG) 、總膽固醇(TC) 、低密度脂蛋白固醇(LDL-C) 、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C) 水平。

1.4.3.4 使用酶聯免疫吸附法(ELISA) 檢測肝組織相關因子含量及酶含量 按照TNF-α、IL-6、轉化生長因子β1(TGF-β1)、DAO、D-LA試劑盒說明書操作。

1.4.3.5 大鼠腸道菌群培養 實時熒光定量 PCR 方法對大鼠糞便中乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌及糞腸球菌 16Sr DNA V3 可變區進行定量分析并制作標準曲線，將提取的大鼠糞便基因組DNA 進行以上 4 種菌株 16Sr DNA V3 可變區熒光定量 PCR 反應，反應體系及反應條件與標準曲線制備相同，由系統軟件 Eppendorf Mastercycler ep realplex 自動分析。PCR 擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的循環次數Ct值，將Ct值代入標準曲線，求出大鼠糞便樣品中菌群的含量。

1.4.3.6 使用Westen Bolt檢測NF-κB蛋白表達情況 以β-actin為內參，使用GIS數碼凝膠圖像處理系統分析得出PCR產物的吸光度值，以NF-κB吸光度值對比，以β-actin的吸光度值表示蛋白表達水平。

1.5 統計學處理 采用SPSS 20.0軟件處理數據，用方差分析組間差異有統計學意義時，進一步采用SNK方法進行比較；用單因素方差分析(ANOVA)時，P<0.05為差異有統計學意義，所有檢驗均為雙側檢驗。

2 結果

2.1 血清乙醇體積分數測定 由圖1可見，使用酒精灌胃后，相比空白對照組，模型組、低劑量腸道益生菌組和高劑量腸道益生菌組大鼠體內乙醇含量1 h有一定程度的升高(P<0.05)，2～3 h時模型組大鼠體內乙醇含量顯著升高，且差異有統計學意義(P<0.01)，高劑量腸道益生菌組顯著高于低劑量腸道益生菌組。

圖1 大鼠血清乙醇體積分數觀察

2.2 大鼠臟體比測量 由圖2可以看出，相比空白對照組，模型組大鼠肝臟臟體比顯著下降，盲體比顯著升高，且差異有統計學意義(P<0.05)；相比模型組，低劑量組和高劑量組肝臟臟體比顯著升高，盲體比顯著降低(P<0.05)，高劑量組肝臟臟體比顯著升高，盲體比顯著降低(P<0.05)。

注：與空白對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.01;與低劑量組比較，dP<0.05

2.3 血清中相關酶指標 由表1可以看出，相比空白對照組，模型組大鼠體內ALT、AST、AKP含量顯著升高，且差異有統計學意義(P<0.01)；低劑量組大鼠體內ALT、AST、AKP含量有一定程度升高，且差異有統計學意義(P<0.01)；高劑量組則差異無統計學意義(P>0.05)。相比模型組，低劑量組、高劑量組大鼠體內ALT、AST、AKP含量顯著降低，且差異有統計學意義(P<0.01)；相比低劑量組，高劑量組大鼠體內ALT、AST、AKP含量顯著降低，且差異有統計學意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠血清中相關酶含量情況

2.4 血脂情況 由表2可以看出，相比空白對照組，模型組大鼠體內TG、TC、LDL-C含量顯著升高，HDL-C含量顯著降低，且差異有統計學意義(P<0.01)；低劑量組、高劑量組大鼠體內TG、TC、LDL-C、HDL-C含量差異無統計學意義(P>0.05)。相比模型組，低劑量組、高劑量組大鼠體內TG、TC、LDL-C含量顯著降低，HDL-C含量顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)，相比低劑量組，高劑量組大鼠體內TG、TC、LDL-C含量顯著降低，HDL-C含量顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)。

表2 各組大鼠血清中相關生化指標

2.5 肝組織相關因子含量 由圖3可以看出，相比空白對照組，模型組大鼠體內TNF-α、IL-6、TGF-β1含量顯著升高，且差異有統計學意義(P<0.01)；低劑量組、高劑量組大鼠體內TNF-α、IL-6、TGF-β1含量差異無統計學意義(P>0.05)。相比模型組，低劑量組、高劑量組大鼠體內TNF-α、IL-6、TGF-β1含量顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)；相比低劑量組，高劑量組大鼠體內TNF-α、IL-6、TGF-β1含量顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)。

注:與空白對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

由表3可以看出，相比空白對照組，模型組大鼠體內DAO、D-LA含量顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)；低劑量組、高劑量組大鼠體內DAO、D-LA含量差異無統計學意義(P>0.05)。相比模型組，低劑量組、高劑量組大鼠體內DAO、D-LA含量顯著降低，且差異有統計學意義(P<0.01)；相比低劑量組，高劑量組大鼠體內DAO、D-LA含量顯著降低，且差異有統計學意義(P<0.01)。

表3 各組大鼠DAO和D-LA含量檢測

2.6 大鼠糞便中的乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌、腸球菌含量測量 由圖4 可以看出，相比空白對照組，模型組大鼠糞便內雙歧桿菌、大腸桿菌、腸球菌含量顯著升高，乳酸桿菌含量顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)；低劑量組、高劑量組大鼠糞便內乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌、腸球菌含量差異無統計學意義(P>0.05)。相比模型組，低劑量組、高劑量組大鼠糞便內乳酸桿菌含量顯著升高，雙歧桿菌、大腸桿菌、腸球菌含量顯著降低，且差異有統計學意義(P<0.01)；相比低劑量組，高劑量組大鼠糞便內乳酸桿菌含量顯著升高，雙歧桿菌、大腸桿菌、腸球菌含量顯著降低，且差異有統計學意義(P<0.01)。

注：與空白對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

2.7 大鼠肝組織NF-κB蛋白表達情況 由圖5 可以看出，相比空白對照組，模型組大鼠NF-κB表達量顯著升高，且差異有統計學意義(P<0.01)；低劑量組、高劑量組大鼠NF-κB表達量差異無統計學意義(P>0.05)。相比模型組，低劑量組、高劑量組大鼠NF-κB表達量顯著降低，且差異有統計學意義(P<0.01)；相比低劑量組，高劑量組大鼠NF-κB表達量顯著降低，且差異有統計學意義(P<0.01)。

注：與空白對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

3 討論

人體腸道中的正常微生物群在腸道不同節段與部位分布不盡相同，其主要生理作用是：生物屏障、免疫屏障等。人體攝入酒精由小腸吸收再由肝臟代謝，長期過大量飲酒會使腸道微生物群的種類和數目發生變化，某些菌群過度繁殖會造成腸道黏膜屏障的完整性破壞，促使內毒素、氨等腸源性毒物滲漏入血液，血液流進肝臟后，加重酒精性脂肪肝損傷[4]。因此，維持腸道微生態穩定，對防治酒精性肝損傷具有重要意義。研究表明：攝入活性益生菌制劑，可以改善腸道菌群失調，常見的腸道益生菌有：雙歧桿菌[5](bifidobacterium) 、乳酸桿菌[6](lactobacillus) 、嗜熱鏈球菌[7](streptococcus thermophilus)等。本實驗中模型大鼠補充腸道益生菌后，大鼠糞便內乳酸桿菌含量顯著升高，雙歧桿菌、大腸桿菌、腸球菌含量顯著降低說明模型大鼠通過服用益生菌，腸道的益生菌群的種類和數量得到改善。

益生菌攝入對酒精導致的肝組織損傷具有一定保護作用，其作用機制可能與益生菌發酵產物有關[8]。其中D-LA 是細菌發酵的代謝產物之一，可以有效地調節腸道的pH值，達到保護腸黏膜的作用。王昕等[9]研究表明：DAO是哺乳動物腸黏膜上層絨毛細胞中的細胞內酶，這種酶和D-LA在腸黏膜細胞遭到破壞時進入血液，從而使得血液中兩種酶的含量成為腸道屏障功能檢測的重要指標。本研究可以看出，使用益生菌灌胃的大鼠血清內D-LA、DAO含量顯著減少，說明益生菌可以有效地緩解腸道黏膜的損傷，防止D-LA、DAO進入血液，減輕了肝臟的負擔，有效地緩解了脂肪肝的進展。這和姚芳芳等[10]研究得出的結論：益生菌可以通過保護腸黏膜達到緩解酒精性脂肪肝相一致。

蔡元麗等[11]實驗表明，肝臟脂肪含量增多，使得血液內炎性因子IL-6及部分血清生化指標發生異常變化。本研究中可以看出，模型組大鼠體內的炎性因子IL-6顯著升高，使用益生菌灌胃后炎性因子含量顯著降低，說明益生菌可以有效緩解腸道內黏膜的通透性，阻止炎性因子進入血液，并有效緩解肝臟負擔。使用益生菌的大鼠血清內TG、TC、LDL-C均顯著降低，說明大鼠脂肪肝得到了有效的緩解。這和唐彬等[12]研究得出的結論：益生菌可以通過降低體內的炎性因子和血清LDL-C含量達到緩解脂肪肝的進展相一致。

NF-κB是多種炎癥介質的上游信號分子，可促進多種炎癥介質的產生[13]。NF-κB可以調控多種急性反應蛋白和細胞因子的轉錄過程，并參與肝臟炎癥的發生。劉鑫等[14]研究表明：TNF-α是肝損傷的重要因子之一，可直接或間接引起肝細胞的免疫損傷。本研究中，模型組大鼠體內NF-κB表達顯著升高，說明大鼠肝臟受損較嚴重，使用益生菌灌胃處理后，大鼠體內NF-κB表達顯著降低，且相關炎性因子的含量也顯著降低，說明益生菌可以有效抑制NF-κB的表達并降低體內炎性因子的表達，從而達到緩解酒精性脂肪肝的發展。這和梁志清等[15]研究結論：益生菌可以通過抑制NF-κB的表達達到緩解酒精性脂肪肝的效果一致。

綜上所述，腸道益生菌補充對酒精性高糖高脂致肝損傷起到保護作用，其作用機制可能與調節腸道益生菌的種類和數目、降低NF-κB蛋白的表達同時降低血清內的炎性因子有關。