基于細胞表面特異識別的熒光標記小分子抗體的鑒定及其應用

張 靜，熊 鳴，李小娟，馬 偉，張達矜，喬媛媛

食管癌是常見的消化道腫瘤，全世界每年有30萬人死于食管癌。我國食管癌的發病率和死亡率也較高。由于早期食管癌缺乏臨床癥狀并且特異性診斷標志也不明確，多數患者確診時已為中晚期，導致治療效果較差，5年生存率低于10%[1]。大量研究表明，循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)可作為監測腫瘤生物學改變及復發轉移的指標，實時監測指導腫瘤的進展、治療及其預后評估[2,3]。噬菌體抗體庫的篩選是獲得人源單鏈抗體的重要策略[4]。利用噬菌體技術篩選純蛋白、完整細胞的特異性抗體都有相關報道[5]。本課題前期應用噬菌體展示技術，針對完整腫瘤細胞高通量篩選富集，獲得與腫瘤細胞表面抗原結合的單鏈噬菌體抗體，這些抗原可能成為腫瘤的靶點，以期為食管癌的診斷和預后提供更多的生物標志[6]。斑馬魚是基因和發育等方面研究的熱門模式動物，可用來進行腫瘤監測和藥物代謝等方面的研究。具有實驗費用相對低、周期短、通量高等優勢，因此本研究應用斑馬魚模型進行體內抗體與移植瘤聚集的示蹤觀察鑒定[7]，根據小分子抗體在動物體內與食管癌移植瘤的結合情況，從而確定篩選的腫瘤細胞抗體能否用于食管癌患者外周血CTCs的檢測。同時課題組采用高通量蛋白質組芯片HuProtTM對小分子抗體可能結合的抗原蛋白表達譜進行篩選和探討，以期得到更準確的抗原種類，篩選出更多的標志物用于腫瘤的早期診斷。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑 基于HuProtTM人類蛋白質組芯片(廣州博翀生物科技有限公司提供)；磁場磁性細胞分離架/器MACS MultiStand(Miltenyi Biotec產品，Bergisch Gladbach,Germany)；抗CD45抗原磁珠，FITC-抗CK8/18/19、PE-抗CD45購自Miltenyi Biotec公司(Bergisch Gladbach, Germany)，細胞周期蛋白依賴性激酶2抗體(4A Biotech)，16%多聚甲醛，甲基纖維素，Triton-100購自Amersco Inc(Solon，OH，USA)； Tris，6孔板(Fisher Scientific，China)；1640培養液，胎牛血清，玻片購自Thermo Fisher Scientific公司(Troy，MI, USA)； DAPI、BSA(St Louis，MI, USA)；枸櫞酸抗凝血采血管(ACD)購自BD公司(NJ, USA)。

1.2 斑馬魚移植瘤模型建立 野生型AB品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。受精后2 d齡，飼養于28 ℃的養魚用水中，實驗動物使用許可證號：SYXK(浙)2012-0171。飼養管理符合國際AAALAC認證。紅色熒光染料(CM-DiI)標記人食管癌細胞KYSE-170或KYSE-180，以顯微注射的方式移植到斑馬魚卵黃囊內，建立斑馬魚人食管癌移植瘤模型。

1.3 熒光標記的小分子抗體與斑馬魚移植瘤聚集示蹤 實驗組30尾斑馬魚，設置空白對照組，陰性對照組，分別靜脈注射不同濃度抗體、陰性對照抗體等。標記綠色熒光Alexa 488的抗體“488-NFC-20b”和“488-NFC-70a”稀釋不同濃度0.11C、0.33C和1.00C，分別注射到斑馬魚靜脈中，陰性對照組同時注射不同濃度的“iF488-OA”，每尾注射量為10 nl；注射后利用熒光顯微鏡觀察小分子抗體在斑馬魚體內的示蹤。通過熒光強度、融合情況等評價抗體與斑馬魚體內食管癌細胞的聚集效應。

1.4 外周血采集 采集5例食管癌患者的外周血，每例7.5 ml，備用。

1.5 基于HuProtTM人類蛋白芯片的蛋白-蛋白互作鑒定抗體 采用HuProtTM蛋白質芯片對NFC20b和NFC70a兩個抗體所結合的抗原種類進行鑒定。將標記熒光小分子抗體滴加在蛋白芯片上，使其與固定于芯片上的蛋白充分結合，清洗去除未結合的抗體。加入熒光標記的二抗(Cy3-anti-mouse IgG)37 ℃孵育，對熒光信號的掃描，根據熒光信號的親和力強弱、數量判讀陽性結果。

1.6 采用ELISA方法對抗原進行驗證 分析蛋白芯片的結果，匹配NFC20b和NFC70a相關的抗原蛋白表達譜，用細胞ELISA法進行驗證。培養KYSE-170、KYSE-180細胞，傳代后接種培養板， 1h后離心棄上清，室溫放置至細胞干燥；加入4%多聚甲醛固定40 min后， Triton-100細胞打孔備用。將抗細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)抗體1∶200稀釋，加入細胞板中，孵育洗滌后，加入HRP標記的二抗(1∶1000稀釋)，再次孵育洗滌，加入OPD底物液顯色，1mol/L H2SO4終止，讀取A490值。陰性對照為抗OA抗體，空白對照為PBS。

2 結 果

2.1 對斑馬魚體內食管癌KYSE-170細胞移植瘤聚集效應評價 標記了紅色熒光的食管癌KYSE170細胞注射到斑馬魚卵黃囊中，形成移植瘤見圖1A， “488-NFC-20b”和“488-NFC-70a”在1 g/L濃度時，從4 h起至24 h，背主動脈、尾動脈和尾靜脈中均能觀察到抗體的分布；同時，“488-NFC-20b”和“488-NFC-70a”在0.11 g/L、0.33 g/L和1.00 g/L濃度，從注射后4 h起，均能觀察到卵黃囊中抗體與腫瘤細胞結合，其中488-NFC-70a抗體在9 h結合活性最高。表明兩個小分子抗體可以通過血液循環分布到卵黃囊，對卵黃囊中的食管癌細胞有明顯的結合聚集效應。而陰性對照品“iF488-OA”在各時間點與腫瘤細胞結合均不明顯。圖1顯示的是兩個小分子抗體在1g/L濃度下與食管癌KYSE-170移植瘤的不同時間點的聚集效應。

圖1 488標記抗體對KYSE-170腫瘤細胞聚集效應

2.2 對斑馬魚體內食管癌KYSE-180細胞移植瘤聚集效應評價 標記了紅色熒光的食管癌KYSE-180細胞注射到斑馬魚卵黃囊中，形成移植瘤。同2.1結果，圖2顯示 “488-NFC-20b”和“488-NFC-70a”小分子抗體在1 g/L濃度下與食管癌KYSE-180移植瘤的不同時間點的結合聚集效應。

圖2 488標記抗體對KYSE-180腫瘤細胞聚集效應

2.3 抗體檢測食管癌患者外周血CTCs 采用Miltenyi免疫磁珠對5例食管癌患者的外周血進行負性富集分離，用Alexa 488標記的NFC20b抗體鑒定CTCs。檢測出3例患者外周血有CTCs，檢測率為60%。本研究所用抗體能夠與食管癌患者CTCs結合，呈現綠色熒光，而白細胞表面抗原CD45染色陰性，核染色DAPI陽性(圖3)。

圖3 食管癌患者外周血CTCs的檢測(×400)

2.4 基于HuProtTM蛋白芯片利用蛋白-蛋白相互作用鑒定單鏈抗體 利用高通量蛋白芯片實驗篩選小分子抗體的抗原表達譜，根據實驗具體情況，通過設置cutoff閾值來確定陽性蛋白，定義cutoff=2，即SNR>2為陽性蛋白。本次共篩選出與NFC20b抗體所結合陽性蛋白23個、NFC70a所結合的陽性蛋白28個。

2.5 初步驗證蛋白芯片結果 采用ELISA法結果發現，KYSE-170、KYSE-180細胞能夠與CDK2(0.89±0.06；0.68±0.04)抗體有效結合，而與卵清蛋白結合很低(0.06±0.00；0.04±0.01)，兩者與食管癌細胞結合活性對比，差異具有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

斑馬魚與人類基因同源性較高，具有繁殖能力強、體外受精發育、胚胎透明、成熟周期較短、個體小、能在顯微鏡下實時觀察等諸多優勢，廣泛用于人類疾病模型的建立、新藥研發和藥物的篩選等方面。近年來，斑馬魚腫瘤移植模型已應用于腫瘤細胞遷移相關基因功能的研究與抗腫瘤藥物的篩選，可在短時間為患者提供精準的個體化治療信息。有學者在胃癌等細胞株構建模型用于腫瘤藥物開發及臨床前藥物篩選的研究中發現，通過斑馬魚可直接觀察抗癌藥物對腫瘤細胞的影響，作為臨床實驗的初始篩選藥物并制定個體化治療方案的依據，為精準腫瘤學的發展提供有效平臺[8,9]。

本研究基于人源噬菌體抗體庫篩選得到食管癌細胞相關抗原的噬菌體抗體技術，改造其中2株抗體NFC20b和NFC70a，進行載體構建，進行原核細胞內抗體重組蛋白的表達。綜合包涵體變性、復性、純化等步驟，得到有生物活性的小分子抗體。小分子抗體標記熒光后，在斑馬魚體內進行抗體與移植瘤聚集的示蹤[7,10]，觀察此前篩選的小分子抗體在斑馬魚體內與食管癌移植瘤結合情況，確定本研究篩選的腫瘤細胞抗體在食管癌患者外周血CTCs的應用基礎。蛋白質組芯片具有高通量、并行、快速分析的優勢，在系統生物學研究中發揮著越來越重要的作用，適用于以蛋白質相互作用為基礎的各種研究領域，在小分子藥物靶向鑒定、單克隆抗體特異性篩選及自身抗體類標志物的篩選等方面應用廣泛[11]。本研究為了更好地開發抗體應用，采用HuProtTM人類蛋白質組芯片對小分子抗體所作用的靶蛋白進行系統性篩選[12]。HuProtTM人類蛋白質組芯片包含20,000個人源重組蛋白質[13]，是目前世界上通量最高的蛋白質芯片，適用于全局性地進行蛋白-蛋白互作、蛋白-核酸互作、蛋白-小分子互作及蛋白翻譯后修飾研究，借助此蛋白質組芯片技術，深入探討這兩個分子的作用。

經過對蛋白功能作用的分析，初步錨定細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)為其中一個抗體NFC20b所結合的抗原，為其應用到食管癌檢出和治療中提供依據。CDK2是細胞周期相關蛋白，細胞周期網絡的異常與腫瘤的發生、發展密切相關，CDKs的異常表達使細胞周期紊亂、細胞增殖失控，最終發生癌變。很多腫瘤細胞系及胃癌、乳腺癌等腫瘤組織中都有CDK基因的擴增、突變和高表達[14,15]。以CDK為中心的細胞周期調控這一領域已成為細胞生物學和腫瘤生物學研究的熱點。通過比較分析確定篩選得到的蛋白的可信性。

綜上所述，本研究探索了一套尋找腫瘤標志物的方法，從大容量抗體庫中篩選抗體，應用斑馬魚移植瘤模型對小分子抗體進行動物體內結合活性的驗證，并用蛋白質芯片技術對其抗原篩選鑒定，得到與抗體直接相互作用的關鍵蛋白質，旨在從高通量篩選的新技術中尋找食管癌的標志物和藥物作用靶點，為食管癌的臨床診斷、預后監測及相關靶向藥物開發提供了一定的思路[16，17]。下一步，將為其他小分子靶蛋白的發現提供更多的研究路線，為食管癌及其他實體瘤的檢測及治療方面的應用研究奠定基礎。