飛行時間質譜技術在腸炎沙門菌快速鑒定及同源性分析中的應用

侯柏龍，王 蔚，高雯潔

（1.嘉興市第一醫(yī)院檢驗科，浙江 嘉興 314000；2.嘉興市疾病預防控制中心，浙江 嘉興 314000）

腸炎沙門菌（Salmonella enteritidis）是目前引起食物中毒的主要病原菌之一[1]，人類感染腸炎沙門菌后常出現腹瀉、嘔吐等典型急性腸胃炎癥狀，少數人出現發(fā)熱。動物對該菌也同樣易感，尤其是被感染的家禽及其制成的家禽制品，由于它們攜帶腸炎沙門菌被人類食用而損害人類健康，甚至造成疫情暴發(fā)。對腸炎沙門菌進行同源性分析，可以追溯傳染源，及時采取措施控制疫情以及預防感染，同時為流行病學研究、食品安全、健康管理方面提供可靠的依據。脈沖場凝膠電泳（plused-field gel electrophoresis，PFGE）是目前國內外普遍應用于細菌分子分型的一種電泳技術，被譽為菌株同源性分析的金標準[2]，然而PFGE 方法比較繁瑣、耗時長、需要各實驗室間協調參數進行比較。基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術作為一種新型的電離質譜技術，近年來發(fā)展快速并應用于微生物的快速鑒定，其處理過程簡便快速，儀器自動化程度高，可以實現96 孔高通量分析，單次成本較低[3]，但是目前運用于菌株同源性分析研究的還較少。基于此，本研究運用PFGE 與MALDI-TOF MS兩種技術分別對11 株從臨床分離得到的腸炎沙門菌進行同源性分析，將兩種技術及其分析后的結果進行比較，進而分析其應用價值，以期為疾病防治以及疫情防控提供科學依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集嘉興市第一醫(yī)院2018 年8 月～12 月患者的腸道標本分離培養(yǎng)沙門氏菌。質控菌株：大腸埃希菌ATCC8739 由法國梅里埃公司惠贈，分子質量參考菌株：沙門氏菌國際標準菌株H9812，由浙江省疾病預防控制中心提供。

1.1.2 試劑與儀器 乙腈；α-氰基-4-羥基肉桂酸基質液CHCA；血平板（法國梅里埃）；木糖賴氨酸去氧膽酸鈉瓊脂平板（XLD）、改良磺綠增菌液（SBG）（上海科瑪嘉微生物技術有限公司），沙門屬60 種診斷血清（寧波天潤生物藥業(yè)有限公司），細菌基因組DNA提取試劑盒；內切酶XbaⅠ（美國Promega）、蛋白酶K（德國MERCK），PFGE 專用瓊脂糖SeaKem Gold Agarose（美國Lonza）。CHEF Mapper 脈沖場凝膠電泳儀和GEL Doc EQ 凝膠成像分析系統（美國DADE BEHRING）；VITEK MALDI_TOF MS 及VITEK-2 Compact 全自動微生物鑒定儀均購自法國梅里埃公司；力康Heal Force 生物安全柜HF safe 1500TE B2II（中國力康）；低溫冰箱（Haier，中國海爾）。

1.2 方法

1.2.1 菌株復蘇及鑒定 將收集的11 株菌株復蘇，涂血平板后于37 ℃培養(yǎng)24 h，分別調0.5 麥氏濁度，采用VITEK-2 Compact 儀器配套GN16 卡進行生化鑒定，并采用沙門菌屬診斷血清進行確認分型。

1.2.2 MALDI-TOF MS 菌種鑒定 采用MALDI-TOF MS SARAMIS 系統對上述菌株進行鑒定：①靶板清洗：用乙醇清洗靶板后待用；②點樣：在生物安全柜內取經18～24 h 培養(yǎng)菌落少量均勻涂于靶板，每個菌株涂1 孔，完全干燥后加CHCA 基質液1 μl，待基質液干燥后移出生物安全柜進行質譜檢測。采用正線性模式，激光頻率60 Hz，加速電壓20 KV，離子源加速電壓167 KV、170 ns 離子延時引出，質譜區(qū)間設定的質核比（M/Z）為2000～20000 Da，質控品為大腸埃希菌ATCC8739，采用VITEK MALDI-TOF MS IVD3.0 版本進行結果比對，檢測結果以成功鑒定為沙門氏菌即可滿足要求。

1.2.3 MALDI-TOF MS 分型與質譜圖的分析比較 在SARAMIS 數據庫界面，導入需進行同源性分析的11株菌，Lanchpad 軟件導出屬于同一型的腸炎沙門菌的質譜圖，進行同源性分析，并形成同源性圖譜。

1.2.4 PFGE 分型 根據沙門氏菌脈沖場凝膠電泳標準操作規(guī)程進行：①細菌的包埋；②細菌的裂解；③清洗膠塊；④膠塊內DNA 的酶切；⑤加樣和電泳；⑥圖像獲取；⑦數據分析。用Xba 1 內切酶在37 ℃下酶切4 h，然后上機電泳，分子量30～700 K，初始轉換時間2.16 s，終末轉換時間63.8 s，電壓梯度6 V/cm，夾角120°，線性，電泳起始電流140 mA。

1.3 統計學方法 將獲得的11 株腸炎沙門菌的PFGE 圖譜用BioNumerics 6.6 軟件分析，并使用非加權配對算術平均法進行聚類分析，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 菌株鑒定結果 收集得到的11 株菌株經法國生物梅里埃公司VITEK 2compact 全自動微生物分析儀鑒定為沙門菌屬歷時約228 min，而MALDI-TOF MS 鑒定只需8 min，二者比較，差異統計學意義（P＜0.05），且鑒定結果全部正確，見圖1。血清凝集試驗結果：A～F 多價O 抗血清：（+），O 因子O1：（+）、O9：（+）、O12：（+），H 因子Hg：（+）、Hm：（+），鹽水對照：（-）符合腸炎沙門菌血清型。

圖1 兩種方法鑒定腸炎沙門菌時間比較

2.2 菌株分型結果

2.2.1 MALDI-TOF MS 分型結果 以相對相似度＞80%為同一型的分型方法，MALDI-TOF MS 分型共分為MS1 型與MS2 型，其中MS1 型占90.91%（10/11）、MS2 型占9.09%（1/11），分型集中于MS1，見圖2。

圖2 11 株腸炎沙門菌MALDI-TOF MS 分型結果

2.2.2 PFGE 分型結果 11 株腸炎沙門菌經酶切處理后上機電泳，得到PFGE 圖譜進行同源性分析，結果顯示菌株相似度在93%～100%。根據聚類相似度＞95%為同一亞型的分型標準，可以將11 株菌株分為E1 型和E2 型，其中E1 型占81.82%（9/11），E2 型占18.18%（2/11），分型集中于E1 型，見圖3。

圖3 11 株腸炎沙門菌PFGE 分型結果

3 討論

沙門氏菌是一類寄居于人類或動物腸道內的革蘭陰性桿菌，在自然界中常見，主要引起人類傷寒、副傷寒、急性腸胃炎、敗血癥、局部感染等疾病，其中腸炎沙門氏菌主要引起人類食物中毒[4]。而我國引起食物中毒的原因中尤以細菌性食物中毒高發(fā)，占各種食物中毒類型的34.84%[5]，因此，快速準確地鑒定沙門氏菌并明確其分型對臨床診療和感染預防均有重要意義。

研究表明[6]，MALDI-TOF MS 鑒定可信度達＞80%，結果較為準確。本研究中利用MALDI-TOF MS與微生物自動生化鑒定系統VITEK 2 分別檢測11株腸炎沙門菌，兩者得到的檢測結果完全一致，MALDI-TOF MS 檢測所需的時間僅為VITEK 2 的1/29，而且對于MAC 平板、SS 平板和HE 平板等常用的選擇性培養(yǎng)基上生長的沙門菌菌株，MALDI-TOF MS均能得到準確的鑒定結果。細菌同源性分析有助于疾病預防部門系統地開展溯源分析及分子流行病學研究，而PFGE 是目前實現這一目標的可靠方法，但其實驗繁瑣、耗時長，臨床難以常規(guī)開展。本研究選取了11 株從臨床患者大便標本分離得到的腸炎沙門菌，利用MALDI-TOF MS 得到分型結果進行聚類分析，然后與“金標準”的PFGE 分型結果相比較，結果發(fā)現兩者分型結果相似度達73%，提示MALDI-TOF MS用于腸炎沙門菌同源性分析僅可以做參考，準確結果目前仍需要借助PFGE 技術來得到。但有研究顯示[7]，MALDI-TOF MS 可對肺炎克雷伯菌進行同源性分析，結果可靠。有研究顯示[8]，該技術運用于鮑曼不動桿菌、鼠傷寒沙門菌等的同源性分析時同樣具有快速、高通量的優(yōu)點。另有研究表明[9]，將臨床菌株質譜數據補充至質譜儀鑒定數據庫，可以增加MALDITOF MS 對沙門菌的分型鑒定能力。本研究中MALDI-TOF MS 對11 株腸炎沙門氏菌同源性分析結果與PFGE 有差異，可能與本實驗所用的菌株數量過少出現偶然性有關，需要進一步豐富采集的腸炎沙門菌數量進行實驗；也可能是由于血清學方法是根據細菌的抗原差異來區(qū)分類型，而MALDI-TOF MS 是通過檢測細菌菌體核糖體蛋白質來區(qū)分類型，同一種菌株的不同菌體之間表面的組成分布不完全相同，因為細菌的遺傳狀態(tài)、基質選擇、培養(yǎng)條件及抗生素使用所導致耐藥譜的不同均會影響菌株的蛋白表達，進而造成分型確定的不穩(wěn)定性[9]。

綜上所述，MALDI-TOF MS 技術用于快速鑒定沙門氏菌，結果可靠。MALDI-TOF MS 技術可以作為腸炎沙門菌同源性分析方法的參考，為疾病防治以及疫情防控提供寶貴的時間差。但暫時還不能完全代替PFGE 方法作為同源性分析的金標準，日后將增加實驗菌株數目繼續(xù)實驗以及進一步完善MALDI-TOF MS 比對數據庫。