TLR4 在高血壓基底節區腦出血患者破裂動脈的表達研究

姚慶和 黃建圍 曹東彪 陶山偉

腦血管疾病是嚴重危害人類健康的一類疾病,死亡率約占所有疾病的10%,50%～70%的存活者遺留有肢體癱瘓、失語、智力障礙等嚴重殘疾。腦出血約占全部腦卒中的8%～14%,死亡率高,存活患者也往往遺留嚴重的神經功能障礙。腦出血最常見的是長期高血壓導致的基底節區腦動脈破裂出血,腦細小動脈的硬化在發病機制中占有重要地位,但腦動脈硬化的病理機制尚不十分清楚,目前發現伴有免疫反應的慢性炎癥過程在動脈硬化的發生發展過程中起著決定性作用。本研究通過手術中切取高血壓基底節區腦出血患者已破裂動脈止血后的殘端,檢查Toll 樣受體(Toll-like receptors,TLR)家族中TLR4 在高血壓基底節區腦出血患者破裂動脈的表達,探討TLR4 在促進腦動脈硬化形成的作用,為腦出血的防治提供新的思路。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2017 年1 月～2019 年4 月收治的20例高血壓基底節區腦出血患者,其中男13例,女7 例；年齡42～68 歲,中位年齡55.4 歲；高血壓病史1～19 年,平均高血壓病史7.8 年；發病至入院時間1～6 h,平均發病至入院時間2.3 h；均經頭顱CT 掃描檢查確診為基底節區腦出血；出血量44～86 ml,平均出血量61.6 ml；格拉斯哥昏迷量表(GCS)評分：8～12 分7 例,3～8 分13 例,平均GCS 評分6.6 分。

1.2 方法

1.2.1 手術方法 采用全身麻醉,額顳部弧形切口,游離骨瓣開顱,手術顯微鏡下由顳上回皮層造瘺進入血腫腔,緩慢吸除血腫,在基底節區血腫底部尋找破裂動脈,在破裂口近端數毫米處雙極電凝止血,切除止血后的殘端部分約2～3 mm。同時在額顳部頭皮弧形切口已切斷顳淺動脈的分支切取2～3 mm 后止血,不影響頭皮切口愈合(切除高血壓基底節區腦出血已破裂動脈止血后的血管殘端,頭皮切口中已切斷的顳淺動脈分支2～3 mm,而并非切取患者的正常腦動脈和頭皮動脈,因此對患者治療和預后無任何不利影響,此研究已經通過醫院倫理委員會審查并獲批準)。切取標本甲醛固定,石蠟包埋。術中根據腦壓情況決定是否保留顱骨骨瓣,術后給予脫水降顱壓、止血、營養神經等藥物治療,病情穩定后轉康復科行神經功能康復。

1.2.2 免疫組織化學檢測 石蠟組織塊切片后,0.3%過氧化氫甲醇溶液［30%過氧化氫1 ml+甲醇80 ml+磷酸緩沖鹽溶液(PBS) 19 ml］處理30 min,0.3%Triton X-100 的PBS 處理 30 min,然后浸入鼠抗TLR4 單克隆抗體(1∶100)孵育48 h(4℃),浸入生物素化兔抗小鼠二抗(1∶500)孵育2 h(室溫),浸入親和素-生物素-過氧化物酶復合物(ABC)(1∶500)孵育2 h(室溫),蒸餾水快速沖洗后在DAB-H2O2溶液中進行呈色反應20～30 min,當陽性產物呈棕褐色而背底清晰時終止顯色。以上步驟每步后均需0.01 mol/L PBS 清洗3 次,10 min/次。其中一抗用含1%牛血清和0.3%的Triton X-100 的PBS 稀釋,二抗和ABC 復合物用PBS 稀釋。貼片,脫水,透明,中性樹膠封片。在5 個高倍視野(400×)計數破裂動脈與顳淺動脈壁中TLR4 免疫反應陽性細胞個數,取平均數。

1.3 統計學方法 采用SPSS24.0 統計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差()表示,采用t檢驗；P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 治療結果 手術后均復查頭顱CT,腦內血腫清除程度為76%～95%,神經外科住院時間14～35 d,平均住院時間21.4 d,隨訪6～12 月,無死亡病例,20 例均意識恢復,對側肢體肌力0～4 級,均遺留不同程度對側肢體偏癱癥狀。

2.2 免疫組織化學檢測結果 20 例患者中破裂動脈TLR4 表達呈陽性,而顳淺動脈TLR4 低表達。見圖1。

2.3 TLR4 表達陽性細胞計數 破裂動脈每400×高倍視野下TLR4 表達陽性細胞數為(31.35±3.08),高于顳淺動脈的(3.36±1.17),差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 TLR4 免疫組織化學染色后破裂動脈與顳淺動脈的表達

圖2 每400×高倍視野下TLR4 表達陽性細胞數(aP<0.05)

3 討論

高血壓腦出血是臨床常見的一種嚴重腦血管疾病,其中最常見的是基底節區腦出血,占所有高血壓腦出血患者的40%～50%。腦內小動脈本身具有不同于其他小動脈的一些組織學特點,如血管壁較薄、血管周圍無堅實的組織支持,故較其他臟器較容易發生出血。同時長期的高血壓可以造成小動脈的內膜損傷,血漿中的某些成分通過損傷的內膜進入內膜下層,引起自身免疫反應介導的炎性反應,形成硬化、斑塊甚至玻璃樣變,這使得腦動脈內膜的完整性受到損害,以至形成微動脈瘤或管壁壞死。近年來,許多研究發現細小動脈的病理變化在腦出血的發病機制中占有十分重要的地位,其中尤以細小動脈硬化及玻璃樣變性為高血壓腦出血的首要血管病理改變［1,2］。

動脈硬化及斑塊形成是多方面因素相互作用的結果,炎癥反應、脂質代謝紊亂、內皮功能失調、氧化應激、機械力學、理化因素等多種發病機制參與動脈硬化和血管重塑的形成［3-5］。隨著近年來基礎研究及科研水平的不斷進步,對腦動脈硬化形成及其發生發展規律的研究也逐漸由細胞水平深入到分子水平,發現在動脈硬化過程中,伴有免疫反應的慢性炎癥過程在動脈硬化的發生發展過程中起著決定性作用［5,6］。

TLR 是免疫細胞表面識別病原相關分子模式的一種模式識別家族受體,其作為一類重要的蛋白質分子參與非特異性免疫(天然免疫)。經過十多年的探索,已陸續發現10 余個TLRs 家族成員,其中TLR4 與動脈粥樣硬化形成關系較為密切［7］。TLR4 主要在髓源性細胞(如單核巨噬細胞)上表達,與特定的配體結合,激活細胞內活化通路,促使相關炎性因子和Ⅰ型干擾素的基因表達。在腦組織內,腦小血管病變誘發的認知障礙與海馬組織內的TLR4 過表達和膠質細胞的炎性反應密切相關［8,9］。近年來,國內外越來越多的科研成果證實TLR(尤其TLR4)在動脈硬化斑塊發生發展中發揮著重要作用,主要表現在慢性炎癥和免疫反應的相互作用中起著決定性的橋梁作用［7,10］。Gibson等［11］研究揭示,TLR4 在動脈硬化病變血管內膜成纖維細胞中的表達較正常血管內膜升高,炎性因子在脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)作用下,刺激血管內平滑肌細胞,快速增生的平滑肌細胞具有催化動脈硬化斑塊形成的作用。Michelsen 等［12］對敲除TLR4 基因小鼠研究表明,正常組小鼠的動脈硬化斑塊面積及厚度明顯高于TLR4 基因缺失小鼠,氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)等因子也可使TLR4 在動脈硬化斑塊組織中的表達量增加。越來越多的證據表明,TLR4 作為免疫反應和慢性炎癥之間聯系的橋梁,在動脈斑塊形成過程中有著復雜的調控系統［13-15］。多種炎癥因子或趨化因子可能通過TLRs 信號傳導通路途徑造成動脈硬化,而抑制TLRs 的表達則抑制動脈硬化的發生［16］。目前研究認為［17］,TLR4 的信號通路主要有兩條途徑：一條是髓樣分化因子 88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)途徑,另一條是MyD88 非依賴途徑。最新研究表明,在實驗腦出血大鼠模型中,激活TLR4-MyD88-JNK(Jun N-terminal kinase)信號通路能夠促進腦組織的炎性反應,進而促進神經組織凋亡［18］。當胞外信號傳遞到胞內,胞內結構域TIR 與MyD88 的羥基端結合,同時 MyD88 氨基端再與白細胞介素-1(IL-1)受體相關激酶4(IL-1 receptor-associated kinase 4,IRAK4)結合,激活IRAK4。IRAK4 磷酸化后與MyD88 分離,進一步和腫瘤壞死因子(TNF)相關受體因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)相互作用。TRAF6 激活核因子κB(NF-κB)抑制物的激酶(Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinases,IKKs)復合體,誘導IκB (Inhibitor of nuclear factor kappa-B)磷酸化。磷酸化的IκB 從復合物中分離出來,直接靶向泛素化和蛋白酶體降解,從而激活轉錄因子NF-κB。釋放的NF-κB 位于細胞核,介導多種促炎細胞因子基因的表達［19］。IKKs 的信號通路激活MAPK 級聯導致另一個轉錄因子激活蛋白-1(AP-1)的激活。它們都在促炎細胞因子的表達中發揮重要作用［20］。通過抑制TLR4/NF-κB 通路可以減輕血管內皮細胞炎性反應,減弱血管內皮細胞損傷［21,22］。MyD88 非依賴途徑是由易位關聯膜蛋白(Translocating chain-associated membrane protein,TRAM)啟動的。依賴β 干擾素TIR 結構域連接蛋白(TIR domaincontaining adaptor inducing IFN-β,TRIF) 被 招募后,與IKKs 相互作用,實現轉錄因子IRF3 的磷酸化［23］。TRIF 還能與IRAK1 相互作用,激活轉錄因子干擾素調節因子7(Interferon regulatory factory 7,IRF7)。激活的IRFs 轉移到細胞核,與DNA 結合,產生β 型干擾素(IFN-β)等抗病毒分子［24］。TRIF 還通過受體相互作用蛋白1(Receptor-interacting protein 1,RIP1)來激活MyD88 非依賴的NF-κB 途徑。RIP1 與TRIF結合,導致Fas 相關的死亡域依賴性凋亡和NF-κB激活［25］。目前TLR4 在動脈粥樣硬化疾病作用中的研究大多集中在頸動脈、冠狀動脈和周圍動脈,對腦細小動脈硬化形成的研究相對較少,許多研究主要在動物模型或者尸檢組織中進行,缺乏直接在高血壓基底節區腦出血患者破裂動脈上TLR4 表達情況的研究及相關性的分析。

本研究在手術中直接切取高血壓基底節區腦出血患者已破裂動脈止血后的殘端,然后應用免疫組織化學技術檢測TLR4 在其的表達情況,并與同一患者頭皮切口中切開顳淺動脈分支的表達情況進行對比,分析TLR4 與破裂動脈病理改變的相關性,直接在人類組織驗證TLR4 促進腦動脈硬化形成的作用,結果顯示破裂動脈TLR4 較高的表達,而顳淺動脈TLR4 低表達,提示了TLR4 在腦細小動脈硬化形成中有一定的作用,是高血壓基底節區腦出血的部分原因,為尋找新的干預靶點提供了一定的實驗依據,為高血壓腦出血的防治提供了一種思路。