miR-7-5p靶向KLF4基因調(diào)控食管癌細(xì)胞的增殖和遷移能力

彭 慧，陳 丹，李東林，魏蜀亮

食管癌是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，具有高致死率。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2018年全球食管癌約有57萬(wàn)例新診斷病例和51萬(wàn)例死亡病例，其中中國(guó)占新發(fā)病例的大部分，是全世界主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。盡管食管癌的診斷技術(shù)和治療取得了進(jìn)步，但食管癌患者的總體生存率仍然很差，因此食管癌新的治療方法對(duì)提高患者生存率具有重大意義[2]。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類高度保守的內(nèi)源性表達(dá)的小型非編碼RNA，它們可以是腫瘤的啟動(dòng)子或抑制因子[3]。miR-7-5p在非小細(xì)胞肺癌和肝細(xì)胞肝癌等多種惡性腫瘤中被報(bào)道為抑癌因子，與腫瘤惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[4-5]。目前，miR-7-5p在食管癌中的相關(guān)研究未見(jiàn)有報(bào)道。miRNA通過(guò)與相應(yīng)靶信使RNA（mRNA）的3’-非翻譯區(qū)（3’-untranslated region，3’-UTR）直接相互作用并通過(guò)miRNA切割，在轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)中發(fā)揮主要作用[6]。在結(jié)直腸癌中Krüppel樣因子4（Krüppel-like factor 4，KLF4）基因被證實(shí)是miR-7-5p的直接靶標(biāo)[7]，KLF4屬于KLF家族成員，具有進(jìn)化上高度保守的哺乳動(dòng)物鋅指結(jié)構(gòu)。KLF4在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可以發(fā)揮癌基因的作用也可以發(fā)揮抑癌基因的作用[8-9]，其在食管癌中發(fā)揮的作用也不一致[10-11]。因此本文對(duì)miR-7-5p靶向KLF4在食管癌中發(fā)揮的作用進(jìn)行了探究。

1 材料與方法

1.1 組織樣本

選擇2017年1月—2018年6月本院收治的40例食管癌患者的癌組織及其配對(duì)的癌旁組織（距離癌組織＞5 cm的非癌組織的標(biāo)本）。所有患者手術(shù)前均未接受化療或放射治療，食管癌組織和癌旁組織均經(jīng)病理學(xué)確診。標(biāo)本收集獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署了知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞和試劑

食管癌TE1、Eca109和EC9706細(xì)胞以及人食管鱗狀上皮細(xì)胞Het-1購(gòu)自美國(guó)模式菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；TRIzol試劑、PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄和SYBR Premix EX TaqTMⅡqRT-PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；miR-7-5p、KLF4基因、內(nèi)參照U6和GAPDH基因引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；miR-7-5p-模擬物（mimics）及陰性對(duì)照（negative control，NC）-mimics、攜帶有KLF4全基因的過(guò)表達(dá)KLF4質(zhì)粒（重組載體pcDNA3.0-KLF4）（over-expression-KLF4，OEKLF4）及空載體pcDNA3.0、攜帶有KLF4全基因的重組質(zhì)粒pGLO-KLF4-野生型（wild type，WT）（KLF4-WT）和重組質(zhì)粒pGLO-KLF4-突變型（mutant type，MUT）（KLF4-MUT）購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)道基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物試劑有限公司；MTS增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)北京百奧萊博科技有限公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Coring公司；RIPA和BCA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶試劑有限公司；兔抗人Wnt3a、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）和內(nèi)參照GAPDH多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）的羊抗兔IgG購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)組織中miR-7-5p及KLF4 mRNA的表達(dá)水平

手術(shù)切除的新鮮組織即刻放入液氮中凍存。取部分組織，經(jīng)研缽研磨為組織粉末后加入TRIzol試劑，提取組織中的RNA。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBR Premix EX TaqTMⅡqRT-PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增；條件為95 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s、70 ℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。用2－ΔΔCt值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以U6為內(nèi)參照計(jì)算miR-7-5p的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參照計(jì)算KLF4 mRNA相對(duì)表達(dá)量。miR-7-5p上游引物序列 為5’-AAAACTGCTGCCAAAACCAC-3’，下游引物序列為5’-GCTGCATTTTACAGCGACCAA-3’；U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，下游引物序列為5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’；KLF4基因上游引物序列為5’-CCCACATGAAGCGACTTCCC-3’，下 游引物序列為5’-CAGGTCCAGGAGATCGTTGAA-3’；GAPDH基因上游引物序列為5’-GTGAACCATGAGAAGTATG-3’，下游引物序列為5’-CGGCCATCACGCCACAGTTTC-3’。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

食管癌細(xì)胞TE1、Eca109、EC9706和人食管鱗狀上皮細(xì)胞Het-1復(fù)蘇后重懸至含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、全濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞融合度約為95%時(shí)，按照1∶3的比例進(jìn)行傳代。待細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)，采用胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，PBS洗3次，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-7-5p和KLF4 mRNA的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)流程同1.3節(jié)。

將miR-7-5p表達(dá)水平最低的食管癌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后，以1×105個(gè)的密度接種于6孔板中，分 為NC-mimics組、miR-7-5p-mimics組和miR-7-5p-mimics＋OE-KLF4組。細(xì)胞接種12 h后采用LipofectAMINE 2000進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，miR-7-5p-mimics轉(zhuǎn)入TE1細(xì)胞為miR-7-5p-mimics組，miR-7-5p-mimics和攜帶有KLF4全基因的重組載體[過(guò)表達(dá)KLF4（OE-KLF4）]共轉(zhuǎn)入TE1細(xì)胞為miR-7-5p-mimics＋OEKLF4組，以轉(zhuǎn)入無(wú)相關(guān)性的NC-mimics作為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后更換為新鮮培養(yǎng)葉繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 miR-7-5p靶向調(diào)控KLF4基因的驗(yàn)證

TargetScan 7.1軟 件（http://www.targetscan.org/）預(yù)測(cè)miR-7-5p可能的靶基因。將KLF4的野生型3’-UTR和突變型3’-UTR分別被插入到基于pGL3的熒光素酶報(bào)道質(zhì)粒中，構(gòu)成KLF4-WT和KLF4-MUT重組質(zhì)粒。

將miR-7-5p表達(dá)最低的食管癌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后，以3 000個(gè)/孔的密度接種到96孔板中，分為KLF4-WT＋NC-mimics組，KLF4-WT＋miR-7-5p-mimics組；KLF4-MUT＋NCmimics組和KLF4-MUT＋miR-7-5p-mimics組。收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)道基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.6 MTS實(shí)驗(yàn)

選擇miR-7-5p表達(dá)最低的食管癌TE1細(xì)胞，以1 500個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中，分為NC-mimics組、miR-7-5p-mimics組 和miR-7-5p-mimics＋OE-KLF4組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)流程同1.4節(jié)，分別在細(xì)胞轉(zhuǎn)染的0、24、48和72 h時(shí)，加入30 μL MTS試劑，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、全濕度培養(yǎng)箱中孵育2 h。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞在490 nm處的D值。

1.7 Transwell小室法檢測(cè)TE1細(xì)胞的遷移能力

收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，用PBS洗滌3次后，以5×104個(gè)細(xì)胞重懸于100 μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液中，加至Transwell小室上室的微孔膜上；將Transwell小室放入含有500 μL完全培養(yǎng)液的24孔板中，使微孔膜與24孔板中的培養(yǎng)液接觸。置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后終止培養(yǎng)；用PBS將微孔膜上室面細(xì)胞的洗去后，用無(wú)水甲醇溶液固定細(xì)胞、結(jié)晶紫染色后，觀察細(xì)胞形態(tài)，隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Wnt3a蛋白的表達(dá)水平

收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，PBS洗滌3次后，加入RIPA試劑重懸細(xì)胞，超聲裂解30 min后低溫離心，收集上清液移，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取適量蛋白加入上樣緩沖液，煮沸進(jìn)行蛋白變性，上樣行10%的SDS-PAGE分離蛋白，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含8%脫脂牛奶的封閉液封閉非特異性蛋白；加入一抗[兔抗人Wnt3a、β-catenin和GAPDH多克隆抗體（體積稀釋比例為1∶500）]4 ℃孵育過(guò)夜，隨后加入二抗[HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1∶8 000）]，室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)均以表示，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析2組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，單因素方差比較3組及3組以上的統(tǒng)計(jì)差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析采用的Pearson相關(guān)性統(tǒng)計(jì)。所有的實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次或以上。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組織中miR-7-5p和KLF4的表達(dá)水平

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)miR-7-5p和KLF4分別在食管癌和癌旁組織中的表達(dá)水平。結(jié)果（圖1A）顯示，miR-7-5p在食管癌組織中的表達(dá)量為0.78±0.46，在癌旁組織中的表達(dá)量為1.00±0.50，與癌旁組織相比，食管癌組織中miR-7-5p的表達(dá)水平下降（t＝2.06，P＝0.043）。KLF4 mRNA在食管癌組織中的表達(dá)為1.83±0.75，在癌旁組織中的表達(dá)為1.00±0.55，與癌旁組織相比，食管癌組織中KLF4 mRNA的表達(dá)水平增加（t＝5.71，P＝0.000）（圖1B）。

2.2 miR-7-5p和KLF4 mRNA在食管癌組織中的表達(dá)相關(guān)性

Pearson分析結(jié)果（圖2）顯示，miR-7-5p和KLF4 mRNA在食管癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性（r＝－0.601，P＜0.05）。

2.3 食管癌細(xì)胞系中miR-7-5p和KLF4 mRNA的表達(dá)水平

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-7-5p和KLF4 mRMA在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)果（圖3A）發(fā)現(xiàn)，miR-7-5p在食管癌TE1、Eca109和EC9706細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.19±0.03、0.65±0.06和0.50±0.02，在人食管鱗狀上皮細(xì)胞Het-1中的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.00；與Het-1細(xì)胞相比，miR-7-5p在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)水平均明顯下調(diào)（P值均＜0.001），以在TE1細(xì)胞中表達(dá)量最低。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)果（圖3B）顯示，KLF4 mRMA在TE1、Eca109和EC9706細(xì) 胞中的表達(dá)量分別為6.79±0.69、5.83±0.52和4.09±0.12，在Het-1細(xì)胞中的表達(dá)量為1.00±0.00；與Het-1細(xì)胞相比，KLF4 mRMA在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)水平均明顯上調(diào)（P值均＜0.001）。

2.4 miR-7-5p對(duì)KLF4的靶向調(diào)控作用

TargetScan 7.1軟件在線預(yù)測(cè)結(jié)果（圖4A）顯示，KLF4基因啟動(dòng)子區(qū)與miR-7-5p具有結(jié)合位點(diǎn)。

雙熒光素酶報(bào)道基因系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果（圖4B）顯示，KLF4-WT＋NC-mimics共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性為1.00±0.02，KLF4-WT＋miR-7-5p-mimics共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性為0.33±0.05，較KLF4-WT＋NC-mimics共轉(zhuǎn)染組明顯降低（t＝4.01，P＝0.006）；而KLF4-MUT＋NC-mimics共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性為1.00±0.05、KLF4-MUT＋miR-7-5pmimics共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性為0.90±0.12，二者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝1.25，P＝0.069）。上述結(jié)果提示，miR-7-5p靶向負(fù)調(diào)控KLF4基因。

2.5 miR-7-5p-mimics轉(zhuǎn)染效果及對(duì)KLF4 mRNA表達(dá)水平的影響

選擇miR-7-5p表達(dá)最低的食管癌細(xì)胞TE1，轉(zhuǎn)入miR-7-5p-mimics。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)果（圖5）顯示，miR-7-5p在NC-mimics組中的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.00，在miR-7-5pmimics組中的相對(duì)表達(dá)量為8.35±0.97；與NCmimics組相比，miR-7-5p-mimics組中miR-7-5p的表達(dá)水平明顯上調(diào)（t＝3.47，P＝0.018）。KLF4 mRNA在NC-mimics組中的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.00，在miR-7-5p-mimics組中的相對(duì)表達(dá)量為為0.46±0.15，與NC-mimics組相比，miR-7-5p-mimics組中KLF4 mRNA的表達(dá)水平明顯下調(diào)（t＝2.99，P＝0.021）。

2.6 miR-7-5p調(diào)控KLF4對(duì)TE1細(xì)胞增殖能力的影響

MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果（圖6）顯示，與NCmimics組相比，miR-7-5p-mimics組和miR-7-5p mimics＋OE-KLF4組TE1細(xì)胞的增殖能力均明顯降低（P值均＜0.05）；而與miR-7-5p-mimics組相比，miR-7-5p-mimics＋OE-KLF4組TE1細(xì)胞的增殖能力增加（P＜0.05）。這一結(jié)果提示，KLF4基因表達(dá)水平的上調(diào)能抑制miR-7-5p對(duì)TE1細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。

Fig.1 Real-timefluorescentquantitativePCRwas usedtodetectthe expressionlevelsofmiR-7-5p(A)andKrüppellikefactor 4 (KLF4)mRNA(B)in40 casesof esophageal cancerandadjacent non-cancerous tissues.*P＜0.05.圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-7-5p（A）和KLF4 mRNA（B）在40例在食管癌和癌旁組織中的表達(dá)水平

Fig.2 Correlation between miR-7-5p and Krüppel-like factor 4 (KLF4) mRNA expression in esophageal cancer tissues.圖2 miR-7-5p和KLF4 mRNA在食管癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

Fig.3 The expression level of miR-7-5p (A) and Krüppel-like factor 4 (KLF4) mRNA (B) in esophageal cancer TE1,Eca109 and EC9706 cells were detected by real-time fluorescent quantitative PCR.***P＜0.05,vs human esophageal squamous epithelial Het-1 cells (n=3).圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-7-5p（A）和KLF4 mRMA（B）在食管癌TE1、Eca109和EC9706細(xì)胞中的表達(dá)水平

Fig.4 The targeted regulation of miR-7-5p on Krüppel-like factor 4 (KLF4).A:The binding site between the promoter region of KLF4 gene and miR-7-5p was predicted using TargetScan 7.1;B:The regulation of miR-7-5p on KLF4 was detected by double luciferase reporter assay.*P＜0.05 (n=3).圖4 采用TargetScan 7.1在線預(yù)測(cè)miR-7-5p與KLF4基因的相關(guān)性（A），并用雙熒光素酶報(bào)道基因系統(tǒng)予以驗(yàn)證（B）

Fig.5 Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect the expression levels of miR-7-5p (A) and Krüppel-like factor 4 (KLF4) mRNA (B) in TE1 cells transfected with negative control (NC)-mimics or miR-7-5pmimics.*P＜0.05,vs NC-mimics group (n=3).圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)入miR-7-5p-mimics對(duì)TE1細(xì)胞中miR-7-5p和KLF4 mRNA表達(dá)水平的影響

Fig.6 The effect of miR-7-5p on the proliferation of TE1 cells through regulating Krüppel-like factor 4(KLF4).*P＜0.05,vs NC-mimics group;△P＜0.05,vs miR-7-5p-mimics group (n=3).圖6 MST法檢測(cè)miR-7-5p調(diào)控KLF4對(duì)TE1細(xì)胞增殖能力的影響

2.7 miR-7-5p調(diào)控KLF4對(duì)TE1細(xì)胞遷移能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果（圖7）顯示，NCmimics組穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)為（79.33±6.5）個(gè)，miR-7-5p-mimics組穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)為（19.67±1.42）個(gè)，miR-7-5p-mimics＋OEKLF4組穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)為（40.67±3.98）個(gè)；與NC-mimics組 相比，miR-7-5p-mimics組 和miR-7-5p-mimics＋OEKLF4組細(xì)胞遷移能力降低（P＜0.05）；而與miR-7-5p-mimics組相比，miR-7-5p mimics＋OE-KLF4組細(xì)胞遷移能力增加（P＜0.05）。這一結(jié)果提示，上調(diào)KLF4基因表達(dá)能減弱miR-7-5p對(duì)TE1細(xì)胞遷移能力的抑制作用。

2.8 miR-7-5p調(diào)控KLF4對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖8）顯示，與NC-mimics組相比，miR-7-5p-mimics組和miR-7-5p mimics＋OE-KLF4組細(xì)胞中Wnt3a和β-catenin蛋白的表達(dá)水平降低。而與miR-7-5pmimics組相比，miR-7-5p-mimics＋OE-KLF4組細(xì)胞中Wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá)增加，KLF4減弱miR-7-5p 對(duì)Wnt3a和β-catenin的抑制作用。

Fig.7 The effect of miR-7-5p on the migration ability of TE1 cells regulating Krüppel-like factor 4 (KLF4)(crystal violet staining,×200).*P＜0.05,vs NC-mimics group;△P＜0.05,vs miR-7-5p-mimics group (n=3).圖7 miR-7-5p調(diào)控KLF4對(duì)TE1細(xì)胞遷移能力的影響

Fig.8 miR-7-5p attenuates the influence of Krüppel-like factor 4 (KLF4) on Wnt/β-catenin pathway.*P＜0.05,vs NC-mimics group;△P＜0.05,vs miR-7-5p-mimics group (n=3).圖8 miR-7-5p負(fù)靶向調(diào)控KLF4對(duì)Wnt/β-catenin的影響

3 討論

食管癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是與腫瘤相關(guān)死亡的第6大主要原因，也是全球第7大最普遍的腫瘤[1]。食管癌包括食管鱗狀細(xì)胞癌和食管腺癌2種組織類型，食管腺癌在發(fā)達(dá)國(guó)家常見(jiàn)，而食管鱗狀細(xì)胞癌在亞洲和其他發(fā)展中國(guó)家更常見(jiàn)，占中國(guó)食管癌病例的90%以上[12]。食管鱗狀細(xì)胞癌具有直接侵襲和早期轉(zhuǎn)移的能力，同時(shí)早期癥狀具有隱匿性，因此食管癌患者在初診時(shí)通常已伴有晚期轉(zhuǎn)移癥狀。早期食管癌患者的治療仍然是手術(shù)切除為主，輔以放化療，而晚期患者的治療主要采取放化療，由于腫瘤具有相當(dāng)大的異質(zhì)性，對(duì)放化療的反應(yīng)差異很大，放化療抵抗性限制了食管癌患者治療效果，導(dǎo)致其預(yù)后較差，5年生存率＜5%[2]。目前，食管癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確，因此研究與食管癌惡性進(jìn)展密切相關(guān)的分子是探索食管癌新型藥物的重要策略。

miRNA是一類短鏈非編碼RNA，長(zhǎng)度為20～24個(gè)核苷酸，目前在人類基因組中注釋了3 000多個(gè)miRNA；miRNA的失調(diào)在許多人類疾病中，尤其在惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，因此可作為腫瘤患者早期診斷的標(biāo)志物或作為患者生存和預(yù)后的預(yù)測(cè)因素。多項(xiàng)研究表明，miRNA可以作為腫瘤治療的靶點(diǎn)進(jìn)行抗腫瘤治療[3]。miR-7是從miR-7-1、miR-7-2和miR-7-3轉(zhuǎn)錄而成的，它們都具有相同的成熟miRNA序列。miR-7-5p是該家族中研究最多的miRNA序列[13]。研究報(bào)道，miR-7-5p在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，其在體外和體內(nèi)均抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[4]；miR-7-5p可抑制肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的人成瘤作用，腫瘤體積和質(zhì)量的增長(zhǎng)[5]；上述研究提示，miR-7-5p在非小細(xì)胞肺癌和肝細(xì)胞肝癌中發(fā)揮抑癌作用[4-5]，但是其在食管癌中的作用仍未知。因此，本研究中首先檢測(cè)了miR-7-5p在食管癌組織中的表達(dá)水平，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與配對(duì)的食管癌癌旁組織相比，食管癌組織中miR-7-5p的表達(dá)水平下調(diào)，表明miR-7-5p在食管癌中可能也發(fā)揮抑癌作用。miR-7-5p在結(jié)直腸癌組織中的低表達(dá)能夠預(yù)測(cè)患者5年總體生存率低，其過(guò)表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移能力[7]。本研究未對(duì)患者的預(yù)后進(jìn)行隨訪，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中需擴(kuò)大組織樣本進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究在細(xì)胞水平探討了miR-7-5p在食管癌中發(fā)揮的具體作用，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示miR-7-5p在3株食管癌細(xì)胞中的表達(dá)均低于其在食管鱗狀上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平，與在組織中的表達(dá)水平一致。選擇miR-7-5p表達(dá)最低的食管癌細(xì)胞進(jìn)行miR-7-5p-mimics的轉(zhuǎn)染，功能實(shí)驗(yàn)顯示過(guò)表達(dá)miR-7-5p后，食管癌細(xì)胞的增殖和遷移能力均降低，表明miR-7-5p可抑制食管癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展。

一個(gè)miRNA可以調(diào)節(jié)數(shù)百或數(shù)千種不同的mRNA，調(diào)控靶mRNA是miRNA發(fā)揮作用的分子機(jī)制[6]。miR-7-5p已經(jīng)明確的靶基因包括神經(jīng)腫瘤腹側(cè)抗原2（neuro-oncological ventral antigen 2，NOVA2）和p21激活的激酶2（P21-activated kinase 2，PAK2）等基因[4,13]。DONG等[7]報(bào)道，miR-7-5p在結(jié)直腸癌中通過(guò)靶向KLF4基因抑制腫瘤的進(jìn)展，本文采用TargetScan 7.1軟件預(yù)測(cè)miR-7-5p與KLF4的結(jié)合位點(diǎn)，并在食管癌細(xì)胞中利用雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)KLF4是miR-7-5p的靶基因，表明miR-7-5p可能通過(guò)KLF4抑制食管癌的增殖和遷移能力。KLF4是腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，研究報(bào)道顯示其在不同的腫瘤中可能發(fā)揮相反的作用，如KLF4通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）信 號(hào)通路維持結(jié)直腸癌細(xì)胞的干性和間質(zhì)特性[8]，而非小細(xì)胞肺癌中過(guò)表達(dá)KLF4，細(xì)胞的遷移和侵襲能力降低[9]。然而，KLF4在食管癌中的作用報(bào)道也不一致，SHAVERDASHVILI等[10]報(bào)道提示，KLF4通過(guò)激活核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)食管癌細(xì)胞的發(fā)生；CHEN等[11]報(bào)道提示，KLF4通過(guò)凋亡誘導(dǎo)和細(xì)胞周期阻滯增強(qiáng)順鉑對(duì)食管癌細(xì)胞的敏感性。本研究中采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，KLF4 mRNA在食管癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平均明顯升高，并且相關(guān)性分析結(jié)果顯示食管癌組織中KLF4與miR-7-5p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-7-5p-mimics組中KLF4 mRNA的表達(dá)水平明顯降低，表明miR-7-5p負(fù)調(diào)控KLF4的表達(dá)；同時(shí)通過(guò)過(guò)表達(dá)KLF4，在功能研究中發(fā)現(xiàn)KLF4可以回復(fù)miR-7-5p對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用，表明miR-7-5p可能是通過(guò)負(fù)調(diào)控KLF4參與食管癌的進(jìn)展。Wnt3a和β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的重要基因，Wnt/β-catenin是與腫瘤增殖和遷移密切相關(guān)的信號(hào)通路[14]，Wnt3a和β-catenin在食管癌中均高表達(dá)[15]，促進(jìn)食管癌的惡性生物學(xué)行為，而本研究發(fā)現(xiàn)miR-7-5p抑制Wnt3a和β-catenin的表達(dá)，而KLF4可以回調(diào)這種抑制作用，表明miR-7-5p靶向KLF4調(diào)控Wnt/β-catenin抑制食管癌增殖和遷移能力。

綜上所述，miR-7-5p在食管癌組織和細(xì)胞系中低表達(dá)，KLF4在食管癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，miR-7-5p靶向KLF4抑制食管癌細(xì)胞增殖和遷移能力，可能是通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)生的。本研究結(jié)果提示，miR-7-5p可能是治療食管癌的一個(gè)新的分子靶點(diǎn)。