白菜CRM 基因家族的生物信息學(xué)分析

朱 斌，王曉雙，羅 茜，胡 鑫

（1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；2.浙江農(nóng)林大學(xué)，杭州 311300）

CRM（Chloroplast RNA splicing and ribosome maturation）結(jié)構(gòu)域蛋白家族首先在古細(xì)菌和細(xì)菌中被鑒定［1］，被認(rèn)為參與葉綠體和線粒體基因的內(nèi)含子剪接，對(duì)于植物生長發(fā)育起著重要作用［2-5］。CRM結(jié)構(gòu)域蛋白主要葉綠體及線粒體基因參與I 類及II類內(nèi)含子的剪接，并影響葉綠體中 rRNA 的加工［2，6］；CRM 結(jié)構(gòu)域蛋白還通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控來調(diào)節(jié)葉綠體或線粒體相關(guān)基因的表達(dá)［3］；此外，基于擬南芥CRM家族基因的突變體研究表明，部分CRM基因在逆境條件下參與了幼苗的生長，證實(shí)CRM基因可響應(yīng)逆境脅迫［4］。基于其基因結(jié)構(gòu)及所包含的結(jié)構(gòu)域，可將 CRM 家族結(jié)構(gòu)域蛋白分為 4 類：CRS1 亞族、CAF亞族、3 亞族及 4 亞族［1，3］。其中 CRS1 亞族、CAF 亞族及3 亞族基因參與I 類及II 類內(nèi)含子的剪切，4 亞族基因與核糖體亞基組裝相關(guān)［3］。

白菜（Brassica rapa）為十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica）植物，是人類生活極為重要的蔬菜，其富含蛋白質(zhì)、糖類、多種維生素以及鈣、鐵等礦物質(zhì)。白菜存在眾多的變種，多在秋冬季種植，對(duì)低溫有較強(qiáng)的抵抗能力，目前是中國各地乃至東南亞地區(qū)重要的、種植面積最大的蔬菜作物。目前對(duì)于白菜的研究非常廣泛，主要集中在新品種研制、種質(zhì)資源提升、基因組測(cè)序以及分子輔助育種等方面［7，8］。白菜全基因組測(cè)序的完成為發(fā)掘白菜基因家族的研究提供了極大的可能性。近年來，對(duì)于白菜基因家族的研究課題不斷增加，如對(duì)白菜PLD、SAUR、ENT等基因家族進(jìn)行鑒定和生物信息學(xué)的分析［9-11］。CRM基因家族在綠色植物葉綠體生長發(fā)育中起著不可或缺的作用，雖然在水稻［5］、擬南芥（Arabidopsis thaliana）［4］中被系統(tǒng)報(bào)道，但目前還未見對(duì)白菜CRM基因家族的研究。本研究對(duì)白菜CRM基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析，鑒定相應(yīng)的CRM基因，旨在為今后研究白菜CRM基因家族的功能提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 白菜CRM 基因的鑒定

首先通過PFAM（http：//pfam.xfam.org/）獲得CRM基因家族（Pfam：PF01985）的HMM文件，隨后以HMMER 3.1 軟件（HMMER3.1；http：//plants.ensembl.org/index.html）的 Hmmsearch 工具在白菜數(shù)據(jù)庫（http：//bras?sicadb.org/brad/）蛋白序列中進(jìn)行全基因組篩選，獲得候選CRM基因，然后利用Pfam 網(wǎng)站的Sequence search 功能和 SMART 網(wǎng)站的 Normal mode 對(duì)獲得的白菜候選CRM基因進(jìn)行蛋白序列結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，剔除不具有完整結(jié)構(gòu)域的候選基因，最終確定白菜CRM基因家族成員的序列。以蛋白質(zhì)分析軟件Expasy（http：//web.expasy.org/protparam/）分析白菜 CRM 蛋白成員的分子量、等電點(diǎn)、氨基酸數(shù)量。

1.2 白菜CRM 基因家族的進(jìn)化分析

利用Clustal X 對(duì)擬南芥和白菜CRM基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)［12］，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值，隨后利用 MEGA 7.0［13］軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap 校驗(yàn)值設(shè)置為1 000，其余參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。

1.3 白菜CRM 基因在染色體上的定位

從 Ensembl（http：//plants. ensembl. org/Triticum_aestivum/Info/Index）白菜基因組數(shù)據(jù)庫中確定CRM基因的初始染色體位置和染色體長度，同時(shí)下載白菜基因組的注釋文件。利用Tbtools［14］軟件對(duì)白菜CRM基因在染色體上的分布進(jìn)行可視化，作圖。

1.4 白菜CRM 基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)域和基序的特征分析

從 Ensembl（http：//plants. ensembl. org/Triticum_aestivum/Info/Index）白菜基因組數(shù)據(jù)庫獲得白菜CRM基因的CDS和基因組序列以及注釋文件。利用SMART domain search database（http：//smart.embl.de/smart/batch.pl）對(duì)CRM基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，利用在線程序 MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）分析CRM基因家族蛋白序列的保守基序，預(yù)測(cè)基序數(shù)量為10個(gè)，其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。利用TBtools軟件對(duì)CRM基因的基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)域和基序進(jìn)行可視化。

1.5 白菜CRM 基因的表達(dá)分析

從 GEO 數(shù)據(jù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi）中下載了 GSE43245 和 GSE69785［15］的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析白菜CRM基因在愈傷組織（callus）、花器官（flower）、葉片（leaf）、根（root）、角果（silique）和莖（stem）中的組織特異表達(dá)，同時(shí)對(duì)Flg22 與Ps脅迫下的差異表達(dá)進(jìn)行了分析，并用R 語言中的pheatmap 軟件包繪制了基因表達(dá)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 白菜CRM 基因的預(yù)測(cè)、分類及系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過生物信息手段在白菜基因組中共預(yù)測(cè)到22 個(gè)CRM基因（表 1）。為進(jìn)一步研究白菜CRM基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，使用MEGA7.0 構(gòu)建白菜與擬南芥（Arabidopsis thaliana）的CRM基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。系統(tǒng)進(jìn)化樹包含了38 個(gè)CRM基因，其中16 個(gè)基因來自于擬南芥（Arabidopsis thaliana），22 個(gè)基因來自于白菜。根據(jù)進(jìn)化樹結(jié)果，38 個(gè)CRM基因可分為3 個(gè)類群，類群Ⅰ包含15 個(gè)CRM基因，其中6 個(gè)擬南芥基因及9 個(gè)白菜基因；類群Ⅱ包含10 個(gè)CRM基因，其中 4 個(gè)基因來自擬南芥，6 個(gè)基因來自白菜；類群Ⅲ包含13 個(gè)CRM基因，其中6 個(gè)基因來自擬南芥，7 個(gè)基因來自白菜。

2.2 白菜CRM 基因家族成員在染色體上的分布

為了探究CRM基因在白菜基因組中的分布，分析了白菜基因組注釋信息，并通過Tbtools 軟件將其可視化（圖2）。結(jié)果表明，22 個(gè)白菜的CRM基因分布于除A10 外的9 條染色體上（1~4 個(gè)基因），且這些CRM基因并未成簇分布。其中A03 染色體上分布4個(gè)CRM基因；A02、A04、A05 染色體上分別有 3 個(gè)CRM基因；A01、A06、A07 和 A09 染色體上分別有 2個(gè)CRM基因；A08 染色體上僅有 1 個(gè)CRM基因。

2.3 白菜CRM 基因結(jié)構(gòu)和序列分析

不同CRM基因的蛋白編碼序列存在較大差異（表1），22 條CRM基 因編碼 長度范 圍為 657（Bra011945.1）~5 909 bp（Bra023555.1），平均長度為2 848 bp；蛋白長度為152（Bra022317.1）~1 917 aa（Bra023555.1），平均長度為580 aa；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為 17.24 k（Bra022317.1）~126.99 kDa（Bra023555.1），其等電點(diǎn)范圍為4.42（Bra033596.1）~9.89（Bra022317.1），有13 個(gè)蛋白等電點(diǎn)大于7，偏堿性，其余9 個(gè)蛋白等電點(diǎn)小于7，偏酸性，說明大部分CRM基因家族編碼

的蛋白質(zhì)富含堿性氨基酸。

表1 白菜CRM 基因分布及位置信息

2.4 白菜CRM 家族基因結(jié)構(gòu)與保守基序分析

如圖3 所示，白菜CRM家族所有基因都有內(nèi)含子，且數(shù)量差異明顯。其外顯子的數(shù)目從2 個(gè)（Bra022317.1、Bra036994.1、Bra011945.1）到 13 個(gè)（Bra039123.1）不等，其中第Ⅰ類群含有的外顯子數(shù)目最多，第Ⅱ類群的外顯子數(shù)量最少，不同成員之間基因長度差距較大。但總體上，含有相同外顯子數(shù)量的成員，其外顯子長度和分布差異較小，系統(tǒng)發(fā)育樹顯示親緣關(guān)系越近的基因，其基因結(jié)構(gòu)和長度越相似。

為進(jìn)一步分析白菜CRM基因家族蛋白序列的差異，利用MEME 在線軟件對(duì)白菜CRM基因家族的保守基序進(jìn)行分析，共獲得10 個(gè)保守基序，分別命名為Motif 1~ Motif 10。保守基序分析結(jié)果表明，不同的CRM 蛋白具有不同類型和數(shù)目的Motif，CRM基因家族的保守基序存在較大差異，第Ⅰ類群Motif的數(shù)量和種類最多，除了Bra022317.1基因具有2種、Bra036994.1基因具有 4 種類型的 Motif 外，其余CRM基因都具有所有類型的Motif類型；第Ⅱ類群的Motif類型和數(shù)目都非常保守，所有的CRM基因都僅含有 Motif 4、Motif 1、Motif 9、Motif 3、Motif 6 這 5 種類型，且Bra025285.1和Bra033017.1含有 2 個(gè) Motif 4 結(jié)構(gòu)域；第Ⅲ類群中保守基序類型和數(shù)量都較少，且差異較大，在Bra014565.1基因中沒有檢測(cè)到Mo?tif 基序的存在。總體上，系統(tǒng)進(jìn)化樹同一分支上的基因家族成員所含基序種類、數(shù)量和位置差異較小，不同分支成員之間所含基序種類、數(shù)量和位置差異較大，可能不同的CRM 蛋白在生物體內(nèi)發(fā)揮的功能也有所不同。

2.5 白菜CRM 基因組織特異性表達(dá)

利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)白菜中葉、莖、花、角果、根以及愈傷組織中的CRM基因表達(dá)量進(jìn)行分析（圖4A），結(jié)果表明，不同組織中各基因的表達(dá)量高低不同，除Bra022317.1、Bra036994.1和Bra011945.1幾乎不在任何組織和器官中表達(dá)外，其余的CRM基因至少在一個(gè)組織中表達(dá)，其中Bra034894.1及Bra033596.1在所有組織中均有較高水平的表達(dá)，且大多數(shù)基因在葉和莖中呈現(xiàn)出更加顯著上調(diào)的表達(dá)量（t-test，P<0.05）。通過對(duì)這些基因的表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同CRM家族基因在不同組織中的表達(dá)存在較大差異。

2.6 白菜CRM 基因在Flg22 及Ps 脅迫下的表達(dá)分析

Flg22 是人工合成的細(xì)菌鞭毛蛋白中一段N 端由22 個(gè)氨基酸組成的多肽，它具有比鞭毛素更強(qiáng)的活性，能誘導(dǎo)多種防御基因的表達(dá)，從而激發(fā)植物的防御性反應(yīng)［16，17］。研究表明，在病原菌侵染植物的過程中，會(huì)向植物分泌大量的效應(yīng)因子到植物細(xì)胞的不同部位來破壞或延緩植物的防衛(wèi)反應(yīng)，Ps 是大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）侵染植物過程中分泌的一類效應(yīng)因子，能抑制內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而抑制植物的免疫表達(dá)。本研究利用Flg22 及Ps 對(duì)白菜進(jìn)行脅迫，結(jié)果表明，F(xiàn)lg22 脅迫下，與對(duì)照組相比，白菜CRM基因家族中10 個(gè)基因的表達(dá)量顯著下調(diào)表達(dá)（P<0.05），8 個(gè)基因表達(dá)量在脅迫前后無顯著差異（P>0.05），僅有4 個(gè)基因的表達(dá)量表現(xiàn)出輕微的上調(diào)趨勢(shì)，但差異不顯著；而在Ps 脅迫下，14 個(gè)基因的表達(dá)量顯著下調(diào)，其余8 個(gè)基因的表達(dá)量無顯著變化，說明白菜的CRM基因家族可能廣泛響應(yīng)生物脅迫（圖4B）。

3 討論

CRM 蛋白來源于原核生物的核糖體前體結(jié)合蛋白，主要參與線粒體和葉綠體內(nèi)包含Ⅱ型內(nèi)含子基因的剪接，而在真核生物中，CRM 結(jié)構(gòu)域僅在植物細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，且CRM 結(jié)構(gòu)域在古生物和細(xì)菌中是以獨(dú)立蛋白的形式存在，在植物個(gè)體中則是以單個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域的蛋白形式存在［1］。本研究利用生物信息學(xué)的方法對(duì)白菜CRM基因進(jìn)行鑒定，共獲得白菜 22 個(gè)CRM基因，擬南芥 16 個(gè)CRM基因。研究表明，水稻基因組包含 14 個(gè)CRM基因［18］，同水稻基因組相比，蕓薹屬CRM基因出現(xiàn)了擴(kuò)增現(xiàn)象。相較于擬南芥基因組，白菜基因組在進(jìn)化過程中經(jīng)歷過一個(gè)三倍化過程以及隨后的二倍化階段［19］，因此白菜又稱為中間多倍體（Mesopolyploid）。理論上白菜中CRM基因的數(shù)目應(yīng)當(dāng)為擬南芥中的3 倍，本研究在擬南芥基因組中鑒定到16 個(gè)CRM基因，而白菜基因組中鑒定到22 個(gè)CRM基因，遠(yuǎn)低于理論數(shù)目，說明白菜中部分CRM基因在二倍化過程中可能發(fā)生了基因丟失、新功能化或變異，此外，白菜CRM基因的保守基序存在較大差異，而水稻CRM基因的基序高度保守［5］，這可能由白菜基因組二倍化導(dǎo)致，基因組測(cè)序也證實(shí)了白菜基因組存在廣泛的基因丟失及新功能化事件［19］。

通過對(duì)白菜不同組織中CRM基因家族的表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同基因在不同組織中的表達(dá)量存在差異，大多數(shù)CRM基因家族的基因在葉和莖中的表達(dá)量較大，在這些器官中具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，有關(guān)水稻CRM基因家族的研究也證實(shí)CRM基因在幼嫩及新出葉片中表達(dá)量升高［5］，表明CRM基因表達(dá)量的差異可能與光合作用之間存在較大聯(lián)系或者參與葉片的發(fā)育過程，研究證實(shí)水稻中OsCAF1［20］和OsCRS2［21］參與水稻葉綠體的形成。研究表明擬南芥AtCFM4（屬于4 亞族）對(duì)鹽和冷脅迫比較敏感［22］，水稻CRM基因的表達(dá)水平在非生物脅迫下也出現(xiàn)顯著的變化，特別是在鹽脅迫下，所有的CRM基因顯著下調(diào)表達(dá)［5］。本研究以 Flg22 及 Ps 模擬生物脅迫，對(duì)不同脅迫下CRM基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)白菜中CMR基因呈現(xiàn)明顯的下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，說明白菜的CRM基因家族可能廣泛響應(yīng)生物脅迫。本研究首次闡述了CRM基因家族在白菜基因組中的數(shù)目、分布、進(jìn)化特征，并揭示這些基因可能響應(yīng)生物脅迫，為白菜應(yīng)對(duì)生物脅迫研究提供一定的理論基礎(chǔ)。