血漿胺氧化酶交聯明膠及其產物結構表征與性能分析

劉新柱，程 珊，李 玉，王穩航,*

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

明膠是由來源于動物的皮膚、骨頭等結締組織中的膠原蛋白水解而得到的一種天然生物大分子，分子質量為幾萬到幾十萬不等[1]。由于其具有良好的發泡和乳化能力、優良的成膜特性、高水結合能力、較好的生物相容性和良好的生物降解能力等，明膠被廣泛應用于食品、制藥和化妝品等行業中[2-3]。在明膠制備過程中，由于受到酸、堿和熱的作用，原有膠原蛋白分子的三股螺旋結構受到不同程度的破壞，因此所形成的明膠凝膠強度在很多時候不能完全滿足食品加工的需求[4-5]。為了調節明膠蛋白的功能特性，拓寬其在食品工業中的應用范圍，通常采用交聯方式改善明膠的結構與性能[6-7]。通常，蛋白交聯主要分2 種形式：物理交聯和化學交聯。物理交聯是指分子內或分子間的弱鍵相互作用，如氫鍵、范德華力、疏水相互作用、π鍵等，適合于食品加工，但其缺點是交聯強度較小，對蛋白性能的提升能力較小[8-9]。相比而言，蛋白質化學交聯比物理交聯會使蛋白擁有更高更穩定的交聯度以及可控制的蛋白性能改良。化學交聯一般是指分子的共價交聯，包括二硫鍵的形成，其可以通過化學反應實現[10-11]。然而，化學反應在食品加工中往往是禁用的，這是因為通常用的醛類以及一些性質活潑的氧化劑具有生物毒性[12]。相反，通過酶催化形成共價鍵交聯具有反應條件溫和、無毒害、催化高效的優勢，可以有效改善食品蛋白質的特性，是目前最易被人們所接受的蛋白改良手段之一[13-14]。目前在食品領域中用于交聯的酶主要有谷氨酰胺轉氨酶（glutamine transaminase，TG）、多酚氧化酶、過氧化物酶等[12,15]，除TG外，其他的酶法交聯或改性而形成的共價交聯大多屬于氧化交聯，其在蛋白質交聯中的應用已逐漸引起了人們的關注[10,16]。

賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）家族是一類動物體內廣泛存在的氧化酶類，其能夠催化初級胺形成醛再進而形成共價交聯，用于膠原蛋白和彈性蛋白的翻譯后修飾，與組織TG共同維持生物體結締組織的結構形態和力學強度，同時具有多種生理功能。研究表明，LOX交聯膠原蛋白時，其酶學特性會因為Cu2＋的缺失而大大降低，并會導致相關組織缺陷如阻塞性肺疾病、主動脈瘤及各種皮膚和骨骼缺陷等[17]。血漿胺氧化酶（plasma amine oxidase，PAO）是一種與LOX的作用機制相似的氧化酶，其可以氧化初級胺形成醛，隨后形成的活性醛可以進一步反映交聯細胞外基質形成最終的交聯產物[18]。據報道，PAO也是一種銅依賴性酶，Cu2＋參與膠原和彈性蛋白的細胞外加工，但不影響PAO的表達，PAO中活性醛的形成是由PAO活性位點銅介導的直接催化作用的結果[19-20]，其酶學特性會因為Cu2＋的缺失而大大降低。此外，據Jalkanen等[21]研究，通過添加PAO可以加強多肽納米纖維的交聯重組強度。與LOX相比，PAO的優勢在于其具有商業化來源，通常可由動物血液制備而得到，這為進一步拓寬PAO作為新的交聯劑改善蛋白質類產品功能特性打下了基礎。目前，PAO僅有少數報道用于生物材料制備[21]，在食品蛋白質包括明膠的交聯中未見研究，PAO處理明膠結構和功能變化的關系及作用機制的研究還不清楚。

為此，本實驗以明膠為對象，利用不同添加量PAO有無Cu2＋輔助交聯條件下對其交聯，研究交聯后明膠結構和功能特性的變化。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）、Zeta電位測定、流變性能分析、粒徑分析、熒光分光光度等儀器方法對PAO交聯明膠的二級結構及變化進行分析，所得結果將為進一步研究PAO作為新型的食品蛋白質交聯酶提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

A型明膠（食品級、220 Bloom） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；PAO（78 U/g） 美國Sigma公司；冰乙酸、氯化鈉、磷酸氫二鈉、考馬斯亮藍R-250、30%聚丙烯酰胺 天津市江天化工技術有限公司；5×蛋白上樣緩沖液 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Mini VE電泳儀 美國Hercules公司；JSPM-5200原子力顯微鏡 日本電子株式會社；DSC60 DSC儀、RF-5301PC熒光分光光度計 日本島津公司；Tap300Al-G原子力顯微鏡探針 北京安立通科技有限公司；Vecror22 FTIR儀 德國布魯克光譜儀公司；FPA Zeta電位儀 上海久貿貿易有限公司；BT-9300S激光粒度分析儀 中國丹東市百特儀器有限公司；DV-3流變儀美國博力飛公司。

1.3 方法

1.3.1 PAO交聯明膠樣品的制備

將明膠溶于pH 5的醋酸溶液中，配制成質量分數5%的凝膠溶液。隨后將PAO溶于pH值為5的醋酸溶液中，制得酶活力為78 U/mL的酶溶液。將所得到的酶溶液平均分為2 組，參考Kosonenk[19]和Lopez[20]等的研究，其中一組酶溶液中加入50 μL、100 mmol/mL的Cu2＋，另外一組未加入Cu2＋的酶液中加入相同含量的pH值為5的醋酸溶液作為對照。

分別將上述2 組酶液分別按照酶基于明膠含量（0、25、50、100 U/g）的添加量加入到配制好的凝膠體系中，得到共8 個樣品。隨后將所有溶液均放置于37 ℃下攪拌4 h，并將樣品凍干貯存于4 ℃條件下備用。

1.3.2 SDS-PAGE分析

明膠的分子質量分布由SDS-PAGE測定[22]。分別取上述加入了不同濃度酶液的有Cu2＋和無Cu2＋處理凍干8 個樣品各5 mg。分別溶于pH值為7的磷酸緩沖液中，得到質量濃度均為10 mg/mL的凝膠樣品。從中分別取出50 μL樣品加入25 μL蛋白上樣緩沖液混合，隨后所有樣品在100 ℃下加熱煮沸5 min使蛋白變性。按照上述相同的方法配制PAO。將所有樣品混合溶液及Marker加入到配制好的電泳膠中（含5%的濃縮膠與8%的分離膠）。控制所有樣品的上樣量均為25 μL，先用80 V電壓進行實驗，待樣品達到濃縮膠與分離膠的分界線后轉變電壓為120 V直至實驗結束。電泳結束后，用0.1%考馬斯亮藍R-250、50%甲醇和6.8%乙酸配成的染色液染色2 h，隨后用7%冰乙酸、30%甲醇配制成的脫色液進行脫色直至條帶清晰。

1.3.3 SEM分析

參照文獻[23]，將凍干后的樣品放在真空干燥箱中干燥24 h后，取適量的樣品裁剪成約5 mm×5 mm的結構，將其固定在粘有導電膠的載物臺上，標號后進行表面噴金處理，并在5 kV加速電壓下進行微觀測定。

1.3.4 DSC分析

明膠的熱穩定分析采用DSC法[24]。分別取上述加入了不同濃度酶液的有Cu2＋和無Cu2＋處理的明膠樣品20 μL置于液體DSC坩堝內，密封，并用空坩堝作對比。升溫速率為1 ℃/min。不同的樣品分別做3 次平行實驗分析熱穩定性差異。

1.3.5 FTIR分析

參照文獻[25]的測定方法，將凍干后的明膠樣品置于真空干燥箱中，在25 ℃條件下干燥3 d，盡可能減少水分對樣品測定的影響。分別取凍干后的樣品1.0 mg，加入150 mg KBr，置于瑪瑙研缽中，充分研磨成粉末，使壓片后保持透明的片狀的結構。掃描范圍為4 000～400 cm－1，分辨率為4 cm－1，掃描頻率為16 次/分，不同的樣品分別做3 次平行實驗。

1.3.6 Zeta電位測定

參照Kang Pan等[26]的方法。取凍干后的樣品重新溶解在pH值為5的醋酸溶液中獲得0.5 mg/mL的凝膠溶液，將樣品加入到比色皿中約1/3處用Zeta電位儀進行電位測定。測量3 次平行結果取平均值。

1.3.7 流變性能分析

將凍干后的明膠樣品溶于pH值為5的醋酸溶液中獲得50 mg/mL的凝膠溶液，此狀態下的明膠溶液接近凝膠狀態。參考Valencia等[27]的測定方法，取適量樣品在室溫下用DV-3流變儀進行測試，進行應變掃描測定合適的線型黏彈區間，通過對頻率掃描確定彈性模量（G′）和黏性模量（G”）與頻率之間的關系，頻率范圍為0.1～100 Hz。

1.3.8 粒徑分析

將凍干后的明膠樣品溶于pH 5的醋酸溶液中獲得0.5 mg/mL的凝膠溶液，取適量溶液加入到比色皿中，并用蒸餾水作分散劑，采用BT-9300S型激光粒度分布儀測試樣品的粒徑分布，粒徑測試范圍為0.1～341 μm，并用蒸餾水作空白對照。每組樣品平行測定3 次。

1.3.9 熒光分光光度計分析

將凍干后的明膠樣品溶于pH 5的醋酸溶液中獲得50 mg/mL的凝膠溶液，取適量樣品加入到比色皿3/4處，采用Acquire模式，調整激發波長為350 nm，發射波長為370～900 nm，適當調整狹縫參數，進行最大熒光強度測定。

1.4 數據統計與分析

數據均采用SPSS 17.0軟件進行數據的統計學處理，相關表格中數據均以表示，并通過方差分析軟件（ANOVA）進行分析。P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE分析

圖1 明膠在不同處理條件下的SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE patterns of gelatin treated with different concentrations of PAO in the presence and absence of Cu2+

如圖1所示，交聯后的明膠分子鏈在γ處位置顏色更深，不符合明膠的三螺旋結構，即不符合含有少量的γ鏈、β鏈與含量較多的α鏈[28]。推測在γ處PAO里的雜蛋白和γ鏈重疊形成遮擋，造成顏色發深。不加入Cu2＋時，隨著酶活力的增加，明膠大分子質量條帶逐漸加深，使大分子質量組分增加。但是與純膠原條帶相比整體條帶顏色較淺，這可解釋為明膠發生了部分降解，但仍然保留部分三螺旋結構。當加入Cu2＋時，與不加Cu2＋的樣品相比，所有條帶顏色均變淺，部分大分子質量條帶甚至消失，這說明加入100 mmol/mL Cu2＋條件下可能會使明膠變性而酶活力也會受到影響，無法形成有效的結合，因此加入濃度為100 mmol/mL的Cu2＋效果并不是很理想。

2.2 SEM分析

圖2 不同條件處理下明膠樣品的SEM圖像Fig. 2 SEM images of gelatin samples treated with different concentrations of PAO in the presence and absence of Cu2＋

由圖2可以看出，純明膠（對照品）呈現較松散的結構，層次結構中有較多的空隙存在，并且內壁較厚且光滑。隨著PAO的添加（不加入Cu2＋），明膠的結構變得越來越緊密，結構空隙也越來越小，當酶活力增加到100 U/g時，明膠表面的結構最為致密并且光滑，看不到層次結構，這可以解釋為PAO可以與明膠發生交聯，最終使明膠的網絡結構變得更為致密。當加入Cu2＋后，純明膠的結構變得更為松散，這可能是因為在加入Cu2＋條件下，明膠發生變性，導致其結構變得疏松；同時，隨著酶含量的增加，明膠的網絡結構也呈現一定程度的緊密，但是層狀結構并不明顯，并且明膠網絡比未加入Cu2＋的樣品空隙大，這說明在100 mmol/mL Cu2＋存在條件下，Cu2＋可能會阻礙酶與明膠的交聯，未交聯的酶填充到明膠的網絡結構中，使結構變得緊實，但這并不排除其他適宜濃度的Cu2＋促進明膠與酶發生交聯的可能性，包括明膠中原有的金屬元素也可能通過提高PAO酶活性促進了交聯[29]。

2.3 DSC分析

從表1和圖3可以看出，在不加入Cu2＋時，峰值溫度與焓變的變化趨勢保持一致，這說明酶的加入能夠使明膠的網絡結構變得更加穩定；隨著PAO添加量的增加，PAO與部分解螺旋結構的明膠發生交聯并且會增加分子間作用力，因此破壞其結構需要更多的熱量。當加入Cu2＋時，Tm與ΔHm的變化趨勢均與未加入時趨勢相反，Cu2＋會破壞酶與明膠的結構，使其發生變性，無法產生相互交聯作用及分子間相互作用。這一結果也與電泳和SEM結果一致。在50 U/g＋Cu2＋時焓變最大，這可能由于該添加量為明膠分子間交聯及Cu2＋與部分帶負電荷的基團發生靜電相互作用的合適添加量；而隨著PAO添加量的增大，PAO會干擾明膠的空間結構，明膠分子逐漸變的不穩定，破壞其結構需要的熱量減少。

表1 不同樣品DSC測定的峰值溫度（Tm）與焓變（ΔHm）Table 1 Peak values (Tm) and enthalpy changes (ΔHm) measured by DSC for different samples

圖3 不同條件處理的明膠樣品的DSC曲線圖Fig. 3 DSC curves of gelatin samples treated under different conditions

2.4 FTIR分析

不同處理明膠樣品的FTIR如圖4所示，參照已有研究方法[30]，其二級結構中酰胺I帶的不同結構含量分析如表2所示。明膠的酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）是分析其結構發生顯著變化的重要特征帶，明膠的結構越穩定，則酰胺I帶中的無規卷曲結構含量越少，而β-折疊、α-螺旋和β-轉角等規則結構含量增加，反之，明膠的網絡結構變得不穩定，無規卷曲含量增加。在不加入Cu2＋時，隨著PAO添加量的增大，無規卷曲含量顯著增加，β-折疊和β-轉角先減少后增加，α-螺旋先增加后減少，這可能是由于不同含量的酶與明膠的多肽鏈發生不同程度的交聯，并且產生不同含量的次級鍵，使明膠中的肽鏈發生聚合，形成穩定的二級結構。當加入Cu2＋后，明膠中的無規卷曲含量先增加后減少，并且在50 U/g時無規卷曲含量最多，α-螺旋含量先增加后減少，這可能是由于Cu2＋的存在破壞打亂二級結構，但在PAO添加量為50 U/g時發生靜電相互作用力最大，明膠帶負電的COO-含量的減少，阻礙了明膠鏈之間的交聯，不能形成緊密的網絡結構，因此在該PAO添加量下無規卷曲含量最多。

圖4 不同明膠樣品的FTIR圖Fig. 4 FTIR spectra of gelatin samples

表2 明膠FTIR圖酰胺I帶結構分析Table 2 Secondary structure analysis of gelatin samples based on amide I band in FTIR spectra%

2.5 Zeta電位分析

Zeta電位表示體系的穩定性，Zeta電位（正或負）越高，分子或分散粒子越小，體系越穩定；反之，Zeta電位（正或負）越低，越傾向于凝結或凝聚[31]。從圖5a可以看出，在不加入Cu2＋時，電位整體偏向于負值，說明該明膠為酸性明膠。隨著PAO添加量的增加，電位逐漸趨向于負值，說明酶的加入與明膠中存在的酸性基團發生有效結合，PAO氧化端肽的堿性賴氨酸形成α-氨基脂肪-δ-半醛，隨后與另一個氨基或者醛形成共價交聯，形成的網絡結構呈現酸性。如圖5b所示，當加入Cu2＋后，明膠的整體電位呈現中性，并且不同含量的明膠電位無明顯變化，這說明Cu2＋的加入與明膠及酶之間發生靜電相互作用，并且會破壞明膠分子結構，使酶變性，阻礙明膠分子的相互作用。

圖5 不同處理條件下所得明膠的Zeta電位圖Fig. 5 Zeta potential curves of gelatin treated under different conditions

2.6 流變性能分析

圖6 明膠的流變學特性曲線Fig. 6 Rheological properties of gelatin samples

明膠的凝膠現象是由于蛋白質分子間的相互作用造成的，如氫鍵、靜電相互作用等[32]，將其溶于酸醋有利于打破這種弱鍵相互作用，進而利于分析共價交聯的區別。如圖6所示，純明膠為典型的牛頓流體，隨著酶含量的增加，明膠的牛頓流體行為減弱，而表現出假塑性，這可能是由于明膠與PAO的相互作用的原因。G′大于G′′，說明體系以彈性為主，反映明膠的凝膠特性。當加入Cu2＋后，明膠的彈性模量和黏性模量均呈現增大的趨勢，且隨著剪切頻率的增大而增大，呈現線性相關，說明Cu2＋的存在影響明膠的網絡結構，使明膠的凝膠特性提高，這可能是由于Cu2＋與明膠發生靜電相互作用的結果。此外，明膠樣品的曲線出現的不平滑性，可能是由于交聯或凍干過程中造成的明膠聚集物的出現而導到結構的不均一性和高彈性所致。

2.7 粒徑分析

圖7 不同處理條件下明膠的粒徑分布Fig. 7 Particle size distribution of gelatin under different treatment conditions

從圖7可以看出，在未加入PAO時，明膠主要分布在小分子質量范圍內（0.764～0.850 μm），而在大分子質量分布范圍內（18.97～61.61 μm）含量較少。隨著PAO添加量的增加，明膠小分子含量逐漸減少，而大分子含量增加，說明酶的加入使明膠分子發生交聯，纖維之間相互聚合，分子內氫鍵及相互作用力等增加，使明膠的結構緊密，最終使分子質量增加。這一結果也與前面的電泳分析結果一致。當加入Cu2＋后，小分子質量比未加入Cu2＋時減少，而大分子質量增加，這說明Cu2＋的加入可以與明膠分子鏈發生結合，使分子鏈增大，從而大分子質量增加。大分子質量的分布范圍最大，原因可能是由于空間位阻效應使該條件下發生的聚合程度最大，使結構最為致密。當酶含量為50 U/g時，Cu2＋對明膠分子質量分布影響最為明顯。

2.8 熒光分析

圖8 不同處理條件下明膠的熒光分布圖Fig. 8 Fluorescence intensity of gelatin under different treatment conditions with and without Cu2＋

樣品經過光源激發后使處于基態的分子吸收激發光后變為激發態，激發態不穩定會重新返回到基態，該過程的能量釋放產生熒光。酶與膠原交聯可以產生熒光性物質[33]。明膠經過酶與Cu2＋處理后，由于酶含量的不同及是否添加Cu2＋而導致其熒光強度發生變化。從圖8可以看出，所有樣品顯示2 個不同的峰，分別為400～450 nm與700 nm波長處左右的峰（其中700 nm波長處的峰為倍頻峰，在這里不做分析）。從圖8a可以看出，隨著PAO添加量的增加，明膠的熒光強度呈現先增加后減少的趨勢，并且在PAO添加量為25 U/g時熒光強度最大，這可以解釋為在PAO添加量為25 U/g時酶與明膠交聯產生的熒光性物質含量最多，即交聯強度最大；隨著PAO添加量的繼續增加，過多的酶可能填充到交聯的網絡間隙，對熒光性物質產生阻礙，因此熒光強度減小。加入Cu2＋處理后，熒光強度也呈現先增大后減小的趨勢，但是在PAO添加量為50 U/g處的熒光強度最大。這可能是因為Cu2＋的存在與明膠發生離子相互作用，進一步影響明膠的網狀結構，使明膠及酶的構象發生改變，進而影響熒光特性。

3 結 論

本實驗以PAO作為交聯劑對明膠分子進行酶法改性，分析了酶處理后明膠的分子質量、分子結構和相關性能的變化。SDS-PAGE結果顯示，隨著加入PAO添加量的增大，蛋白質大分子質量條帶含量增加，表明明膠分子間發生了交聯。同時，從SEM圖可以看出，發生交聯后的明膠結構由松散變得越來越緊密，結構空隙越來越小，網絡結構更為致密。FTIR分析結果表明明膠由于分子間交聯而逐漸形成了穩定的二級結構。DSC結果表明加入PAO后明膠網絡結構的熱穩定性有提高。更為重要的是，流變性能與粒徑分析的結果表明隨著PAO添加量的增多，明膠聚集度逐漸增加，顆粒不斷增加，進而提高明膠的黏彈性。熒光分光測定結果顯示，明膠的熒光強度呈現先增加后減少的趨勢，在PAO添加量為50 U/g時熒光強度最大，交聯的效果最好。此外，與對照組相比，添加100 mmol/mL Cu2＋并不能對交聯起到積極的作用，反而會對交聯起到阻礙作用。研究結果表明在無Cu2＋作為輔助因子的情況下PAO也能夠交聯明膠分子并對其性能的改良具有積極的效果，初步證明了PAO作為新型的氧化酶交聯食品蛋白質的可能性，其具體機制包括輔助因子的確切影響以及PAO對其他蛋白質的交聯效果仍需進一步研究。