基于高通量測序對茅臺鎮醬香白酒主釀區霉菌菌群結構多樣性的解析

朱治宇，黃永光

（貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

以貴州茅臺酒為代表的醬香型白酒工藝復雜、香氣成分豐富，具有醬香突出、酒體醇厚、空杯留香持久等特點[1]。醬香白酒釀造是自然開放式、多菌固態發酵過程，其中開放式制曲和堆積發酵是網羅環境微生物必不可少的工藝[2]，說明釀造環境中必然大量存在與發酵相關的微生物。王雪山[3]對清香白酒大曲、環境（地面、工具等）以及新廠和老廠之間進行了微生物多樣性探究，結果表明不同環境中、不同廠區之間微生物種群結構均具有明顯差異；任愛容等[4]采用傳統可培養技術從醬香白酒大曲和環境中得到細菌28 個屬，其中大曲18 個屬、環境24 個屬，結果表明大曲與環境微生態結構具有差異性，環境微生物多樣性較高，為發酵提供了必需的微生物資源；Wang Qiang等[5]應用DGGE技術發現茅臺酒發酵酒醅中多種微生物來源于大曲、窖泥、原料和環境（空氣、灰塵和地面等）；羅方雯等[6]應用高通量技術從醬香白酒釀造區域環境和大曲中檢測到多種酵母，且大曲中90%以上的酵母來源于環境。由此可見，研究釀造環境微生物多樣性對深入解析醬香白酒發酵機理具有重要意義。

大曲作為糖化發酵劑，富含多種酶系和微生物資源，對提升發酵動力和酒體風格具有重要意義[7-8]，制曲過程包含細菌、酵母、霉菌等菌群結構的演替，其中霉菌在釀造過程發揮著重要作用，能產生糖化酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等水解酶系，對降解發酵原料和產生白酒中呈香呈味物質具有重要貢獻[9-10]。夏玙等[11]采用高通量測序分析大曲中真菌群落結構差異，發現嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、根毛霉屬（Rhizomucor）、曲霉菌屬（Aspergillus）等霉菌是大曲中的優勢真菌類群；班世棟等[12]采用傳統可培養技術從醬香型白酒大曲中分離得到Aspergillus、紅曲霉屬（Monascus）、毛霉屬（Mucor）、青霉屬（Penicillium）、Rhizomucor等19 株霉菌；李靜心等[13]采用高通量測序技術從大曲中分離出Aspergillus、Thermomyces和Rhizomucor等優勢霉菌。研究結果表明，醬香大曲中霉菌資源豐富，其復雜的菌群多樣性結構和演替規律值得深入探討。

本課題基于MiSeq平臺，采用高通量測序技術系統性研究茅臺鎮主釀區生產大曲和釀造環境中霉菌菌群結構多樣性（跟蹤整個醬香白酒釀造周期）。實驗樣品來源于茅臺鎮釀酒企業相對集中的7 個主釀區，同時采用可培養技術完善數據并加以驗證，采用統計學方法分析各主釀區之間、生產大曲和釀造環境之間霉菌菌群結構差異性，通過對比各主釀區霉菌多樣性指數、富集率、衰減率和遷移率變化，以期為醬香白酒生產大曲和釀造環境微生態結構研究提供數據基礎，并從微生物角度為酒廠的選址提供理論依據。課題組同時對各主釀區堆積發酵和窖池發酵過程中微生物結構多樣性進行實驗探究，以期完善醬香白酒微生物數據庫的科學性和全面性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品取自貴州省茅臺鎮TMS、GT、DDH等17 家醬香型白酒公司的白酒生產車間2018—2019年1～7輪次主釀區環境和大曲。

DNA Marker（TaKaRa）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、引物（合成） 生工生物工程（上海）股份有限公司；E.Z.N.A. Soil DNA Kit 美國Omega BioTek公司；異丙醇（分析純）、TEA緩沖液北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖 南京生興生物技術有限公司；Goldview染料 上海賽百盛有限公司；rTaqDNA聚合酶試劑盒 北京全式金生物技術有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司。

1.2 儀器與設備

G154DW高壓蒸汽滅菌鍋 致徽（廈門）儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；GeneAmp?9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；DYY-8C型電泳儀北京六一儀器廠；JS-680C凝膠成像儀 上海培清科技有限公司；QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統 美國Promega公司；MiSeq測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

樣品取自貴州省仁懷市茅臺鎮觀音寺區、上坪村、椿樹村、巖灘村、向陽村、盧榮壩村及合馬鎮街道社區共7 個醬香白酒主釀區的17 個代表性釀酒企業，2018年1—9月1～7輪次酒醅堆積發酵期間的釀造環境樣品和生產使用大曲樣品。環境樣品采集：企業生產車間的晾堂、墻角地面土塵、灰塵，窗戶玻璃、窗臺、墻體、行車梯子、配電箱、消防箱、儲酒罐表面的灰塵、粉塵，車間外地面、溝渠表面土質粉塵，對各采樣點均進行固定、定期、定量采集樣品，再將采樣點采集的樣品進行等量均值混勻，每個企業收集混合樣500 g（1 個輪次、1 個企業），準確標記每個取樣點以防被破壞，且每次都在相同取樣點取樣。大曲樣品：在采集環境樣品時于釀酒企業大曲曲房采集使用前的貯存曲樣，每企業取樣量500 g，采樣大曲均為釀酒企業生產。

樣品采集后均密封裝袋，作為該輪次樣品（17 個采集釀造企業1～7輪次共計119 個大曲樣品和119 個環境樣品），并立即運回實驗室即時開展分析研究（24 h內），實驗室留存樣品均放置于-20 ℃冰柜貯存。按照區域劃分將每個酒廠的樣品等量混合為代表一個區域的最終混合樣品（本實驗采用共分為7 個區域，每個區域1 個最終混合樣品，7 個輪次共計49 個大曲最終混合樣品和49 個環境最終混合樣品）。

1.3.2 樣品處理

1）分別取1.3.1節最終混合樣品各16 g于100 mL離心管中，用30 mL滅菌后的0.1 mol/L PBS懸浮，加入3～5 顆玻璃珠，旋渦振蕩7 min，400 r/min離心5 min，取上清液。2）沉淀用PBS洗滌，旋渦振蕩4 min，400 r/min離心5 min，收集上清液。3）將沉淀用PBS洗滌，旋渦振蕩2 min，400 r/min離心5 min，收集上清液。全部上清液于12 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集細胞沉淀。4）預處理結束后，根據E.Z.N.A.?soil DNA Kit的操作說明提取各樣品中的微生物總DNA。

1.3.3 16S rDNA基因擴增及Illumina MiSeq測序

使用16S rDNA通用真菌引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對真菌ITS1FITS2R區域進行擴增。每個樣本做3 個重復。將同一樣品的PCR產物混合后用1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物，Tris-HCl洗脫；1.1%瓊脂糖電泳檢測。

參照電泳初步定量結果，將PCR產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統進行檢測并定量，再按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。連接“Y”字形接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴增進行文庫模板富集，氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段，制備MiSeq PE文庫。再在Illumina MiSeq（PE300）平臺上機測序[14]。

1.4 數據分析

采用WPS 2019進行數據統計，Origin 8.6繪制堆積柱狀圖和柱形圖，RStudio繪制Upset plot、pheatmap、Venn圖及和弦圖。

2 結果與分析

2.1 霉菌多樣性分析

采用堆積柱形圖直觀呈現樣本中各霉菌的相對豐度（平均相對豐度＞0.1%）。對茅臺鎮醬香白酒7 個主釀區大曲和環境樣品霉菌的高通量測序結果進行統計分析，結果如圖1所示。

圖1 主釀區生產用大曲（a）和環境（b）霉菌群落結構多樣性在屬水平上的分布（相對豐度≥0.1%）Fig. 1 Genus-level distribution of mold community structure in Daqu (a)and environmental samples (b) from the main brewing areas (relative abundance ≥ 0.1%)

從7 個主釀區生產用大曲中共檢出霉菌68 個屬，有11 個屬相對豐度至少在一個樣品中超過0.1%（圖1a），分別是：Aspergillus、Auxarthron、Byssochlamys、Microascus、Monascus、Penicillium、Rhizomucor、Rhizopus、Thermoascus、Thermomyces、Trichothecium。其中優勢霉菌屬（相對豐度≥1%）為Aspergillus（4.14%～11.8%）、Byssochlamys（13.0%～44.8%）、Monascus（1.41%～18.8%）、Thermoascus（25.9%～67.4%）、Thermomyces（7.70%～23.3%）、Rhizomucor（0.02%～5.70%）。由圖1a可知，Thermoascus在區域1和區域6相對豐度均高于60%，是7 個區域大曲樣品中平均相對豐度（48.8%）最高的優勢霉菌，Thermoascus具有良好的酶分泌特性，產過氧化氫酶（除去過氧化氫等細胞毒性物質）、內切葡聚糖酶（纖維素酶系主要組成之一）、葡萄糖苷酶（分解葡萄糖苷鍵，是微生物代謝重要酶類之一）、角質酶（食品工業具有催化酯化作用）和幾丁質酶（水解幾丁質抑制真菌病原菌）等多種酶系[15]；Byssochlamys平均相對豐度（22.8%）次之，具有耐熱、耐低氧、耐酸和產果膠酶等特性[16]；Monascus、Aspergillus、Rhizomucor等優勢霉菌同樣產酶豐富，為持續發酵和促進風味及其前體物質的形成提供動力[10,17-18]。本課題同時采用傳統平板分離技術鑒定了7 個主釀區醬香大曲中的可培養霉菌，數據顯示Aspergillus和Thermoascus是樣品中的優勢霉菌（平均相對豐度≥20%），與高通量分析結果對應性較好，但Monascus和Rhizomucor在可培養條件下相對豐度較小且Byssochlamys未篩出，可能是因為可培養與高通量技術存在檢測手段和培養條件的不同，使檢出結果存在一定差異，相比傳統可培養技術，高通量測序分析能更全面與準確地分析樣品的微生態結構[19]。郭敏等[7]應用高通量測序分析，從傳統大曲、機械化大曲制曲過程樣品中檢出真菌共58 個屬，大曲入曲房時優勢霉菌包括Thermoascus、Thermomyces、Aspergillus等；第1次翻曲為Thermoascus、Thermomyces等；第2次翻曲為Byssochlamys、Aspergillus等；出房時為Byssochlamys、Thermomyces等，該實驗對整個制曲過程微生態結構變化進行了解析，具有較高的參考價值。對比分析發現，本實驗大曲樣品中優勢霉菌種類一致但檢出量達到了68 個屬，原因為采集了茅臺鎮大量的企業樣品，樣品豐富導致檢測霉菌相對較多（更多對照結果見表1）。

從7 個主釀區環境中共檢出霉菌89 個屬，有26 個屬相對豐度至少在一個樣品中超過0.1%（圖1b），分別是：Acremonium、Alternaria、Aspergillus、Byssochlamys、Cladosporium、Cyphellophora、Fusarium、Fusicolla、Gibberella、Kabatiella、Lecythophora、Microascus、Monascus、Mortierella、Mucor、Penicillium、Phoma、Pyrenochaeta、Rhizomucor、Rhizopus、Simplicillium、Talaromyces、Thermoascus、Thermomyces、Toxicocladosporium、Trichothecium。其中優勢霉菌屬（平均相對豐度≥1%）為Alternaria（0%～2.80%）、Aspergillus（10.4%～75.9%）、Byssochlamys（2.75%～13.8%）、Cladosporium（0.25%～31.0%）、Fusicolla（0%～2.08%）、Lecythophora（0%～10.7%）、Monascus（0.49%～10.2%）、Penicillium（0.56%～1.93%）、Phoma（0.01%～6.65%）、Pyrenochaeta（0%～22.9%）、Thermoascus（6.19%～49.0%）、Thermomyces（1.81%～12.4%）、Toxicocladosporium（0%～1.65%）。由此可知，在茅臺鎮醬香白酒主釀區環境中存在的霉菌多樣性極其豐富，且部分霉菌（Aspergillus、Byssochlamys、Monascus、Thermoascus、Thermomyces等）在與大曲制曲、貯存、酒醅堆積發酵過程遷移到大曲、酒醅中，并得到富集，成為優勢菌種主導發酵（表1），本實驗與其他研究者檢出的優勢霉菌契合度較高，驗證了優勢霉菌的可靠性。通過對比7 個醬香白酒主釀區環境中的可培養霉菌數據，發現Mucor、Aspergillus、Monascus、Rhizomucor等優勢霉菌在可培養中同樣具有較高的豐度。研究發現雖然環境霉菌種類豐富，但并非都與發酵相關，如Phoma、Alternaria、Cladosporium等環境中的優勢霉菌同時也是常見的病原菌，常寄生于植物引起多種病害[20-22]，可能會由原料或環境遷移到釀造過程，這是需要防控的微生物。

表1 基于高通量測序對主要優勢霉菌的比較分析結果Table 1 Comparative analysis of dominant molds using high-throughput sequencing

綜上結果表明，大曲中優勢霉菌（相對豐度≥1%）種類與前人研究結果具有相似性，通過功能性分析發現這些優勢霉菌有利于發酵；環境霉菌多樣性豐富，提供益生菌的同時也存在大量豐度較高的病原菌，在生產上需要有效防控，盡量避免其遷移到發酵體系中。

2.2 各主釀區間霉菌差異性分析

運用軟件RStudio繪制主釀區大曲霉菌（68 種）和環境霉菌（89 種）Upset plot分析各主釀區之間的霉菌差異性，如圖2所示。結果表明7 個主釀區同時共有的霉菌占比為：大曲（18 種，26.47%）、環境（26 種，29.21%）；而單獨出現在1 個區域的霉菌占比為：大曲（21 種，30.88%）、環境（7 種，7.87%）。數據分析表明：1）在大曲樣品中各主釀區霉菌種群結構差異性較高（高達30.88%），說明各主釀區可能因為原料來源、水源、制曲工藝和發酵環境等因素的影響，使其中微生物多樣性產生較大差異。眾所周知“曲為酒骨”，大曲中富含多種微生物及其代謝產物，推動了酒醅發酵和呈香物質及其前體物質的產生和富集[8]，正是由于各主釀區大曲微生物種群差異性較高，才有可能導致各區域酒廠所釀醬香白酒質量的差異。2）在環境樣品中各主釀區霉菌種群結構差異性較低（7.87%），而7 個主釀區同時共有的霉菌相似度較高（高達29.21%），說明茅臺鎮整個環境微生態結構具有相對穩定性，得天獨厚的地理、氣候條件造就了穩定的微生態大環境，正如“南橘北枳”一樣，這也證實了“離開茅臺鎮，就釀不出茅臺酒”的說法。

圖2 各主釀區大曲（a）和環境（b）樣品霉菌Upset plot分析Fig. 2 Upset plot analysis of mold communities in Daqu (a) and environmental samples (b) from the main brewing areas

為進一步統計分析不同區域大曲和環境樣本中霉菌群落多樣性，采用α多樣性綜合分析主釀區之間的霉菌多樣性差異，繪制Shannon指數、Simpson指數和Pielou指數分析圖，如圖3所示。

圖3 主釀區大曲樣品（a）和環境樣品（b）霉菌多樣性指數圖Fig. 3 Mold diversity indexes of Daqu (a) and environmental samples (b)from the main brewing areas

圖3 結果表明，茅臺鎮7 個主釀區霉菌多樣性具有一定差異，其中大曲樣品霉菌多樣性區域3最高，區域1最低；環境樣品霉菌多樣性區域6最高，區域1最低，主釀區之間的差異表明各區域酒廠具有不同霉菌種群結構。綜合對比發現除區域1、3外，其余區域環境樣品霉菌多樣性均高于大曲樣品，說明環境樣品中霉菌多樣性普遍高于大曲樣品，而釀造環境為醬香白酒堆積發酵和開放式制曲工藝提供了微生物基礎。綜合圖1～3可知，區域2在7 個主釀區中微生態優勢明顯，原因如下：1）區域2環境和大曲樣品中霉菌種類最多且多樣性指數較高，具有霉菌種群資源優勢；2）區域2大曲樣品中霉菌種群結構穩定，有利于發酵的霉菌比重較大；3）釀造過程中Aspergillus分泌酸性糖化酶、蛋白酶等重要酶系，為發酵持續進行和風味物質形成發揮著重要作用[10]，區域2環境樣品中Aspergillus相對豐度最高（高達75.9%），遷移至大曲后同樣具有較高的相對豐度（11.2%），表明區域2中Aspergillus含量高且對發酵環境脅迫耐受性較強，遷移至大曲后能夠成為主導發酵的優勢菌種。綜上可知，區域2整體微生態環境相比其他區域優勢明顯，對提供發酵動力和提升酒體風格具有較大助力，該結論從微生物角度為酒廠的選址提供了理論依據。

2.3 主釀區生產大曲和釀造環境中霉菌種群結構差異性分析

圖4 主釀區環境和大曲樣品霉菌屬水平Venn圖Fig. 4 Venn plot analysis of unique and shared molds between Daqu and environmental samples from the main brewing areas at the genus level

圖5 主釀區大曲樣品優勢霉菌（屬）富集率（a）和環境樣品優勢霉菌（屬）衰減率（b）pheatmap分析Fig. 5 Pheatmap analysis of enrichment rate of dominant mold genera in Daqu samples from main brewing area (a) and decay rate of dominant mold genera in environmental samples (b)

繪制Venn圖直觀分析醬香白酒主釀區環境和大曲樣品中霉菌屬水平差異性。由圖4可知，主釀區環境和大曲樣品共檢出95 種霉菌（屬）包括大曲68 種和環境89 種，其中62 種霉菌同時在2 個類別的樣品中檢出，占大曲樣品的91.18%和環境樣品的69.66%。值得注意的是，大曲中8.82%的霉菌未在環境中發現，這部分霉菌可能來源于原料、空氣或其他途徑，說明環境絕非大曲獲取微生物資源唯一途徑，但大曲在曲房開放式發酵、貯存過程中與環境霉菌資源交互作用最為明顯。

運用軟件RStudio繪制pheatmap分析大曲樣品6 種優勢霉菌（屬）富集率和環境樣品13 種優勢霉菌（屬）衰減率（圖5）。醬香大曲的陳曲過程是對環境微生物的網羅和篩選[27]，并富集優勢霉菌進入酒醅后迅速主導發酵。通過分析大曲樣品6 種優勢霉菌（屬）的富集變化可知（圖5a），Byssochlamys、Monascus、Thermoascus、Thermomyces、Rhizomucor等菌在制曲過程中發生了富集；通過分析環境樣品13 種優勢霉菌（屬）的衰減變化可知（圖5b），Alternaria、Aspergillus、Cladosporium、Fusicolla、Lecythophora、Penicillium、Phoma、Pyrenochaeta、Toxicocladosporium等菌在與大曲進行交互作用過程中發生了衰減。分析以上數據發現：1）各主釀區之間霉菌種群結構共性特征明顯，具有相似的優勢菌群結構。2）如圖5b所示，環境中的優勢霉菌遷移至大曲后因富集環境的變化而發生變化，甚至消亡（Pyrenochaeta）。由于醬香大曲制曲溫度較高（高達58～65 ℃）[28]，對釀酒微生物具有良好的篩選、富集特性，從而抑制了環境中多種酸敗微生物的生長，促進了嗜熱細菌、霉菌的繁殖[29]。另外，高溫大曲在貯存環境富集的優勢霉菌與發酵酒醅中的優勢霉菌契合度非常高（表1），說明當大曲在貯存期從環境中富集的優勢霉菌進入發酵酒醅后能夠迅速調控發酵，這就是醬香高溫大曲必須要經過6 個月的貯存、醬香白酒釀造用曲量大的根本原因。3）Aspergillus是大曲富集的優勢霉菌，但富集率為負，對比可培養霉菌數據發現，曲霉種類繁多，通過平板培養在環境中發現17 種而在大曲中僅發現了8 種，由此可知，盡管曲霉同時作為大曲和環境樣品中的優勢霉菌，但大曲內部條件還是抑制了部分曲霉的生長。

圖6 各主釀區霉菌由環境至大曲的遷移率和弦圖分析Fig. 6 Chord diagram analysis of mold migration from environment to Daqu in the main brewing areas

為進一步分析各主釀區環境中霉菌向大曲的遷移情況，運用軟件RStudio繪制各主釀區霉菌由環境至大曲的遷移率和弦圖（圖6）。和弦越粗表示各主釀區環境霉菌向大曲的遷移率越低（小刻度數值越大遷移率越低），大刻度數值越大遷移率越高。由圖6可知，各主釀區環境霉菌向大曲的遷移率略有不同（79%～98%），表明大曲中至少79%以上的霉菌來自環境中霉菌的遷移，而遷移率不同表明在不同環境中大曲和周圍環境的交互程度存在差異。結合2.2節部分結論分析，可能由于各主釀區大曲微生物遷移率的不同，影響了整個大曲微生態結構，甚至影響了各主釀區酒體風格。

3 結 論

本課題基于MiSeq平臺采用高通量測序技術，對茅臺鎮醬香白酒7 個主釀區釀造大曲和環境樣品霉菌進行解析，共檢出霉菌95 個屬，其中從大曲樣品中檢出68 個屬，環境樣品中檢出89 個屬。通過對霉菌多樣性結構分析，明確了Aspergillus、Byssochlamys、Monascus、Thermoascus、Thermomyces、Rhizomucor等是醬香白酒釀造大曲中的優勢霉菌（相對豐度≥1%）；Alternaria、Aspergillus、Byssochlamys、Cladosporium、Fusicolla、Lecythophora、Monascus、Penicillium、Phoma、Pyrenochaeta、Thermoascus、Thermomyces、Toxicocladosporium等是醬香白酒釀造環境中的優勢霉菌。其中，大曲優勢霉菌種類與前人研究重復率較高，通過功能性分析發現這些優勢霉菌屬有利于發酵；環境霉菌多樣性豐富，提供益生菌的同時也存在大量豐度較高的病原菌，還需要復雜的發酵過程進行篩選。

通過對各主釀區霉菌差異性分析，發現各主釀區霉菌種群結構在大曲樣品中的差異性較高，在環境樣品中的差異性較低，但7 個主釀區同時共有的霉菌相似度較高，說明在茅臺鎮穩定的微生態大環境中，大曲微生物差異性賦予各區域酒廠酒體不同的風格特點；研究發現區域2釀造環境微生態結構相比其他區域優勢明顯，對提供發酵動力和提升酒體風格具有較大助力，該結論從微生物角度為酒廠的選址提供了理論依據；通過對主釀區生產大曲和釀造環境中霉菌種群結構差異性分析，發現大曲在曲房開放式發酵、貯存過程中與環境霉菌資源交互作用明顯，但遷移率的不同表明在不同區域大曲和周圍環境的交互程度存在差異，這種差異可能對整個大曲微生態結構甚至各主釀區酒體風格差異產生重要影響。