胚胎發育形態學和動力學特征在胚胎選擇中的應用價值

鄭愛燕，王瑋，蒲艷，廖桂芝，孟慶霞，偶健，王馥新，李紅，丁潔

(南京醫科大學附屬蘇州醫院 蘇州市立醫院生殖與遺傳中心，蘇州 215002)

胚胎非整倍性是導致體外受精-胚胎移植(IVF-ET)妊娠失敗和早期流產的重要原因之一。胚胎植入前遺傳學檢測(PGT)的出現使胚胎非整倍性檢出成為可能，但該操作需對滋養層細胞(TE)進行活檢，具有創傷性，可能影響胚胎種植潛能[1]。另外，PGT價格昂貴，會增加患者的經濟負擔，其能否在IVF-ET領域廣泛應用仍待商榷。因此，我們希望能夠通過無創方法選擇更具發育潛能的胚胎。從形態學角度評判胚胎質量是最直接也是目前最常用的方法。胚胎實時觀測技術(Time-lapse)的出現使人們可以進一步觀察胚胎發育的整個過程，以及胚胎的特殊分裂行為，如直接分裂(AC)、逆分裂(RC)和亂分裂(CC)等。有研究表明形態學指標、動力學指標與胚胎整倍性相關[2-4]，但也有學者持反對觀點[5-6]。由于胚胎發育受培養環境等眾多因素影響[7]，所以研究數據在不同實驗室之間的可重復性差[8]。因此，本研究從形態學和動力學兩個角度出發，分析本中心行PGT患者的臨床資料，以尋找指導胚胎選擇的形態學和動力學指標，優化胚胎選擇方案以改善種植結局。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2016年1月至2018年12月于我院生殖與遺傳中心就診的行PGT患者的臨床資料。

納入標準：夫妻一方或雙方染色體異常或有遺傳疾病，反復妊娠丟失，反復種植失敗，反復流產或高齡(年齡≥38歲)，且受精方式為卵胞漿內單精子注射(ICSI)者。排除標準：無可用囊胚的PGT周期或未放入時差培養箱培養的PGT周期。

本研究共納入193個周期。根據胚胎整倍性分為整倍體囊胚組(整倍體組，共351個囊胚)和非整倍體囊胚組(非整倍體組，共491個囊胚)；整倍體組又根據是否種植分為種植胚胎組(種植組，共110例患者)和非種植胚胎組(非種植組，共51例患者)。

二、研究方法

1.促排卵及取卵：患者進行常規促排卵，待優勢卵泡直徑達18～20 mm時，長方案患者注射6 500 U重組人絨毛膜促性腺激素(默克，德國)，拮抗劑方案患者注射0.2 mg醋酸曲普瑞林(輝凌，瑞士)或2 000～40 000 U注射用人絨毛膜促性腺激素(珠海麗珠醫藥)+0.1 mg醋酸曲普瑞林，注射34～36 h后在陰道B超引導下取卵，將獲得的卵丘卵母細胞復合體(COCs)洗滌干凈后置于含蛋白的受精液G-IVF Plus(Vitrolife，瑞典)中備用。

2.胚胎實時觀測和胚胎培養：獲卵2～4 h后用透明質酸酶(Sage，美國)去除COCs周圍的顆粒細胞，置于G1 plus培養液(Vitrolife，瑞典)中培養1～2 h行ICSI，ICSI后將卵母細胞放回G1 plus培養液于常規培養箱過夜，培養箱環境為6.0%CO2、5.0%O2、37℃。受精17～19 h后觀察受精情況。將2PN合子放入培養皿(Embryoslide，Vitrolife，丹麥)，置于時差培養箱(Embryo Scope，Vitrolife，丹麥)進行培養，培養箱環境為6.0%CO2、5.0%O2、37℃，設置拍攝間隔為10 min，連續拍攝6 d。

3.Time-lapse系統和胚胎評分：運用Viewer D圖像分析軟件收集2PN胚胎資料，記錄每個胚胎發育的關鍵時間點，包括原核消失、2細胞、3細胞、4細胞、5細胞、8細胞、桑椹胚融合、開始出現囊腔以及囊腔充滿整個透明帶的時間(tPNf、t2、t3、t4、t5、t8、tM、tSB、tB)，其中2細胞到3細胞的發育時間以cc2表示，3細胞到5細胞的發育時間以cc3表示，3細胞到4細胞的發育時間以s2表示，5細胞到8細胞的發育時間以s3表示，同時觀察胚胎異常分裂行為AC和RC，其中AC1為胚胎第1次卵裂時1個細胞分裂為3個細胞的現象，AC2為胚胎除第1次卵裂以外其余各卵裂期1個細胞分裂為3個細胞的現象。胚胎動力學指標包括：tPNf、t2、t3、t4、t5、t8、tM、tSB、tB、cc2、cc3、s2、s3、桑椹胚融合到開始出現囊腔的時間(tSB-tM)和開始出現囊腔到囊腔充滿整個透明帶的時間(tB-tSB)。囊胚形態學評分采用Gardner評分體系[9]，形態學指標包括：囊胚發育天數(D5、D6)、內細胞團(ICM)評分和TE細胞評分。由于活檢時對胚胎進行透明帶打孔，所以未對活檢囊胚進行囊胚擴張程度進行評判。

4.囊胚活檢：胚胎培養至第4天在ICM對側用透明帶激光打孔器(ZIOS-tk，Hamilton Thorne Bio Sciences，美國)打孔，待≥5個TE細胞孵出后進行活檢。固定孵出點對側位，吸住孵出的TE細胞，利用牽引力和激光切割取下5～10個TE細胞，將TE細胞置于Gmops plus培養液(Vitrolife，瑞典)中漂洗3次后放于PCR小管備用。

5.二代測序PGT：活檢后的TE細胞用SurePlex WGA Kit試劑盒(Blue Gnome，美國)進行全基因組擴增后構建文庫。等溫擴增和富集后用Ion Pgmtm Template OT2 200 Kit試劑盒(Thermo，美國)對文庫DNA進行擴增，數據結果用E&S-胚胎染色體異倍性分析系統[10]分析。

6.囊胚解凍移植：患者自然周期或人工周期處理后進行復蘇周期囊胚移植。優先移植整倍體囊胚，若有兩個或兩個以上整倍體囊胚，結合Gardner評分[9]和KID ScoreTM[11]D3/D5評分選擇，每次移植1枚囊胚。

7.臨床結局：移植后14 d測血β-HCG，β-HCG>10 U/L為陽性，陽性者于36 d后行B超檢查，宮內見孕囊者為臨床妊娠。

8.觀察指標：各組胚胎動力學指標、形態學指標和胚胎特殊分裂(AC、RC)形式。整倍體率=整倍體胚胎數/二代測序檢測胚胎數×100%，種植率=孕囊數/移植胚胎數(單卵雙胎算1個孕囊)×100%。

三、統計學分析

結 果

一、納入患者基本情況

納入患者平均年齡(32.2±5.3)歲，體重指數(BMI)(21.8±3.0)kg/m2，FSH(7.2±2.1)U/L、E2(184.1±95.5)pmol/L、LH(5.3±3.9)U/L、抗苗勒管激素(AMH)(4.6±4.1)ng/ml、平均獲卵數(13.9±7.4)枚、成熟卵數(11.7±6.5)枚、正常受精數(9.1±5.1)枚、形成可用囊胚數(5.0±3.5)枚。

二、整倍體組與非整倍體組胚胎發育動力學指標比較

與非整倍體組比較，整倍體組的tPNf、t2、t3、t4、t5、tM、tSB、tB以及tSB-tM等發育動力學指標均顯著降低(P<0.05)，而t8、cc2、cc3、s2、s3和tB-tSB等發育動力學指標比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

三、種植組和非種植組患者的一般情況

根據是否種植將整倍體組又分為種植組和非種植組，兩組患者的一般情況比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

四、種植組和非種植組胚胎發育動力學指標比較

非種植組的tSB-tM顯著低于種植組(P<0.05)，其余各胚胎發育動力學指標比較均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

五、形態學指標和胚胎特殊分裂對囊胚整倍性及整倍體胚胎種植率的影響

D5囊胚的整倍體率顯著高于D6囊胚(P<0.05)，ICM評分中A級囊胚的整倍體率顯著高于B級、C級(P<0.05)，TE細胞評分A、B、C級的整倍體率逐級遞減，差異具有統計學意義(P<0.05)。胚胎特殊分裂(AC和RC)對囊胚的整倍體率無顯著影響(P>0.05)。胚胎特殊分裂(AC和RC)、囊胚發育天數、ICM評分和TE評分對整倍體囊胚的種植率均無顯著影響(P>0.05)(表4)。

表1 整倍體組與非整倍體組胚胎發育動力學指標比較[(-±s)，h]

表2 種植組和非種植組患者一般情況比較(-±s)

表3 種植組和非種植組胚胎發育動力學指標比較 [(-±s)，h]

表4 形態學指標和胚胎特殊分裂對囊胚整倍性及整倍體胚胎種植率的影響(%)

討 論

本研究以胚胎整倍性為基礎，從胚胎發育的形態學和動力學角度出發，探索可能提高胚胎選擇效率的參數。研究結果提示，D5囊胚的整倍體率(46.2%)顯著高于D6囊胚(30.7%)，并且囊胚整倍性隨ICM評分和TE評分升高而增高。整倍體胚胎除t8外，從tPNf到tB的所有細胞分裂時間點均顯著早于非整倍體胚胎，提示胚胎生長發育速度快的囊胚更偏向于整倍體，跟D5活檢囊胚整倍體率較高相呼應。本結論與Barash等[12]的結果一致，而Capalbo等[13]與Rienzi等[6]均認為D5囊胚和D6囊胚的整倍體率無顯著差異。Capalbo等[13]關于ICM評分和TE評分對整倍體率影響的結論和本研究相似，認為隨著ICM評分和TE評分的降低整倍體率顯著降低(P<0.05)。Campbell等[14-15]發現，tM、tB、透明帶厚度變為其原有厚度一半的時間(tEB)均與整倍體性顯著相關(P<0.05)，并以此建立胚胎選擇模型選擇非植入前非整倍體遺傳學檢測(PGT-A)患者胚胎。盡管我們前期關于早期胚胎動力學與胚胎發育潛能的研究表明，cc2、cc3、s2和s3等動力學指標以及胚胎特殊分裂(AC和RC)對于囊胚形成均有顯著影響(P<0.05)，但是這些指標對于囊胚的整倍性卻無顯著影響(P>0.05)，值得注意的是本研究的這幾個指標的值均落在之前研究的優質胚胎參數范圍內[16]。由此可知，這些指標雖然能夠影響早期胚胎的發育潛能，在卵裂期胚胎選擇中起積極的指導意義，但是當卵裂期胚胎形成囊胚后，這些指標并不能預測囊胚整倍性。Desai等[2]也認為胚胎特殊分裂(AC、RC和CC)和胚胎整倍性不相關，但胚胎特殊分裂(AC和CC)與胚胎發育潛能相關，兩種或以上不同分裂異常行為會導致囊胚整倍體率顯著降低(P<0.05)。我們推測其原因可能是由于囊胚生長發育過程本身就是一個胚胎篩選過程，胚胎發育過程中的自我糾錯能力，包括異常細胞的碎片化、桑椹胚形成時細胞的不融合和排出等，使得這些原本具有錯誤分裂的胚胎得到糾正。Lagalla等[17]研究也證實胚胎特殊分裂AC可產生整倍體胚胎。

關于整倍體囊胚種植方面，本研究發現囊胚的形態學評分，即囊胚發育天數、ICM評分和TE評分并不對整倍體囊胚的種植力有預示作用，即選擇形態學更優質的整倍體囊胚并不能提高種植率。Capalbo等[13]也發現整倍體囊胚的種植率跟囊胚的形態和生長速度不相關，但Nazem等[18]和Zhao等[19]卻認為相關。Kimelman等[20]研究發現，在未進行整倍體檢測的囊胚中，D6囊胚的妊娠率和出生率均顯著低于D5囊胚，但是在整倍體囊胚中D6整倍體囊胚的妊娠率和出生率與D5囊胚無顯著差異。因此，我們推測囊胚形態學評分跟種植率的相關性可能只是囊胚形態學評分跟胚胎整倍體相關性的映射。Gazzo等[21]研究發現，EmbryoscopeTM時差培養箱的KS5評分體系可以提高整倍體胚胎的種植率，而本研究發現tSB-tM與整倍體囊胚的種植率相關，種植組tSB-tM顯著大于未種植組(P<0.05)，也就是種植的整倍體囊胚從桑椹胚形成到出現囊胚腔的時間更長，即當評估整倍體性時tSB-tM在整倍體囊胚偏向更短，但是在評估整倍體囊胚的種植時，該值在種植組胚胎偏向于更長。即從桑椹胚形成到開始出現囊腔的時間不能太短也不能太長，需在一個特定范圍內。桑椹胚到囊胚的發育過程存在一系列變化，如卵裂球致密化、卵裂球間形成緊密和縫隙連接、大量表面微絨毛和細胞膜其它成分的重排、胚胎轉錄和翻譯過程增強等。細胞失去全能性，獲得呈放射狀的極性，最終產生兩個細胞群，具有表面微絨毛的外極細胞變成TE，具有緊密聯系的內極細胞變成ICM。由此推測這一進程發展的過快或過慢，都可能會導致某些重要環節出錯，進而影響胚胎發育，甚至后續的臨床結局。Kramer等[22]研究也發現桑椹期致密化的持續時間和人類胚胎整倍體染色體組成之間存在顯著相關。另外，本研究由于樣本數比較少，且種植不僅受胚胎因素影響，還受子宮內膜等多種因素影響，究竟tSB-tM是否能夠作為預測整倍體囊胚種植潛能的動力學指標，我們需謹慎對待，還需進行臨床驗證。

綜上，我們認為胚胎發育時間點發生早的，ICM評分和TE評分高的D5囊胚其整倍體率較高，但若已知胚胎是整倍體時，這些形態學和細胞分裂時間點不能預測種植結局，而尋找那些從桑椹胚形成到開始出現囊胚腔時間略長的整倍體囊胚也許能獲得更好的種植結局。對于一般IVF-ET周期，胚胎上述指標可作為胚胎優選的候選指標，提高臨床結局；對于PGT-A周期，可利用Time-lapse技術致力于獲得整倍體胚胎更高的種植率。