多囊卵巢綜合征患者顆粒細胞中miR-1270及其靶基因CYP19A1的表達及臨床意義

2021-05-19 09:34:18張慧敏朱文倩馬靜徐仰英張玉沈偉郝翠芳

生殖醫學雜志 2021年5期

張慧敏，朱文倩，馬靜，徐仰英，張玉，沈偉，郝翠芳,5*

(1.青島大學醫學部，青島 266071；2.濱州醫學院臨床醫學系，煙臺 264010；3.青島大學附屬青島市婦女兒童醫院生殖中心，青島 266011；4.青島農業大學生命科學學院，青島 266109;5.青島大學附屬煙臺毓璜頂醫院生殖中心，煙臺 264000)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種常見的內分泌疾病[1]，約占育齡婦女的5%～10%[2]，約占無排卵性不孕癥的75%[3]。PCOS是一種異質性綜合征，臨床表型多樣，包括高雄激素血癥、月經不調和多囊卵巢形態[4]。除不孕外，PCOS的表現通常包括肥胖、多毛、胰島素抵抗、高風險的子宮內膜癌、代謝綜合征[5]、2型糖尿病和心血管疾病[6-7]。MicroRNAs(miRNAs)是一種短的非編碼內源性RNA(19～25 bp)，能夠通過與靶信使RNA(mRNA)上3′UTR處的互補核苷酸結合來降低mRNA的穩定性或抑制翻譯[8-9]。有報道指出miR-1270能影響卵巢癌細胞的增殖凋亡，且高表達的miR-1270還能降低卵巢癌細胞對順鉑的敏感性[10-11]。

CYP19A1(Cytochrome P450 19A1 gene)基因編碼的細胞色素P450芳香化酶(P450arom)是雌激素合成的限速酶[12]。雄激素轉化為雌激素(雄激素和睪酮分別轉化為雌酮和雌二醇)時，由于CYP19的異常表達或P450arom的活性抑制而受到限制[13-14]。本研究通過檢測miR-1270及其靶基因CYP19A1在PCOS患者卵丘顆粒細胞中的表達，探討分析其對雌激素生成的影響，為PCOS排卵障礙的分子機制研究提供新的理論依據。

資料與方法

一、研究對象及樣本收集

選擇2019年4月至2020年12月期間在煙臺毓璜頂醫院和青島市婦女兒童醫院生殖中心就診的不孕患者，其中45例月經不調的PCOS患者(煙臺毓璜頂醫院14例，青島市婦女兒童醫院31例)為PCOS組，65例無PCOS的不孕患者作為對照組，記錄兩組患者的基本臨床資料和促排卵情況；并收集兩組患者的卵丘顆粒細胞開展后續實驗室研究。本研究經青島大學附屬煙臺毓璜頂醫院和青島市婦女兒童醫院倫理委員會審批通過。

根據Rotterdam標準(2004)，患者納入PCOS組至少符合以下兩個標準：卵巢多囊樣改變；無排卵或稀發排卵；臨床或生化高雄激素血癥癥狀。排除標準：先天性腎上腺增生、庫欣綜合征與雄激素分泌性腫瘤等高雄激素血癥疾病；甲狀腺功能亢進，高泌乳素血癥等內分泌性疾病；夫婦雙方染色體異常。所有患者年齡小于35歲，均進行體外受精(IVF)或卵胞漿內單精子注射(ICSI)助孕治療。

二、材料

1.主要試劑和儀器：miRNA分離試劑盒(北京天根)；miRcute Plus miRNA第一鏈cDNA試劑盒(北京天根)；SPARKscriptⅡRT-Plus逆轉錄試劑盒(山東思科捷)；SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit(湖南艾科瑞)；QuantStudioTM5實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(Applied Biosystems，美國)；兔抗CYP19A1多抗(ab18995，Abcam，美國)；兔抗β-Actin多抗(D110007，上海生工)；HRP標記的羊抗兔IgG二抗(A0208，上海碧云天)；酶聯免疫吸附測定試劑盒(KGE014，R&D，美國)；雙熒光素酶報告試劑盒(南京諾唯贊)；qRT-PCR引物及雙熒光素酶報告載體由北京擎科新業生物技術有限公司合成；miRNA的過表達模擬物和抑制劑(mimic及inhibitor)及mimic的陰性對照(mimic NC)由蘇州吉瑪有限公司設計合成。

2.細胞株：人卵巢顆粒細胞(KGN)購自上海酶聯生物科技有限公司，人胚腎細胞(293T)由青島農業大學生命科學學院沈偉教授贈予。

3.生物信息學數據庫：NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，RNA22(https：//cm.jefferson. edu/rna22/Precomputed/)，RNAhybrid(https：//bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)用于預測靶mRNA及其結合位點。KEGG信號通路數據庫(https：//www.genome.jp/kegg/pathway.html)用于篩選信號通路。

三、研究方法

1.生物信息學：生物信息學方法預測miR-1270的靶基因，根據靶基因mRNA3′UTR與 miRNAs序列堿基互補的原則篩選兩者最可能的結合位點。

2.臨床資料收集：分別對PCOS組(n=45)及正常對照組(n=65)患者的臨床特征資料進行回顧分析。收集的內容包括：年齡、不孕年限、體重指數(BMI)、抗苗勒管激素(AMH)、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、LH/FSH，雌二醇(E2)、睪酮(T)、孕酮(P)、催乳素(PRL)、空腹血糖(FBG)水平以及竇卵泡數、獲卵數、胚胎形成率。

3.卵丘顆粒細胞的收集和細胞株培養：注射HCG扳機后36 h，超聲引導下經陰道穿刺抽吸直徑≥16 mm的卵泡，獲得卵丘-卵母細胞復合體。用針分離單個卵母細胞周圍的顆粒細胞。在PBS液中清洗3次后，將卵丘顆粒細胞保存在-80℃下直到RNA提取。KGN細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基中，293T細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，細胞培養保持在37℃、5%CO2的環境。

4.RNA提取和qRT-PCR：按照miRNA分離試劑盒說明書提取顆粒細胞總RNA和miRNAs，QuickDrop測定其濃度和純度，分別按照SPARKscriptⅡRT-Plus逆轉錄試劑盒和miRcute-Plus-miRNA第一鏈cDNA試劑盒說明書逆轉錄mRNA和miRNA為cDNA。按照SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit說明書操作，應用QuantStudioTM5 qRT-PCR儀進行擴增反應，分別以GAPDH和U6作為mRNA和miRNA的內參。引物序列如下：GAPDH上游：5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′，下游：5′-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3′；CYP19A1上游：5′-GACTTTGCCACTGAGTTGATTT-3′，下游：5′-CGATCAGCATTTCCAATATGCA-3′；U6上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-1270：5′-GGAGATATGGAAGAGCTGTGT-3′；UnivR-miR：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。mRNA和miRNA均采用以下擴增反應條件：95℃預變性30 s，然后按95℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環。每組重復3次，采用2-△△CT法分析各基因的相對表達量。

5.雙熒光素酶報告基因實驗：在NCBI中查找CYP19A1基因3′UTR序列，根據生物信息學預測與miR-1270的結合位點，設計包含結合位點的序列及突變型序列，長360 bp，由北京擎科新業生物技術有限公司合成并連接于pmirGLO載體上。用感受態大腸桿菌DH5a轉化，挑取陽性單菌落進行搖菌并提取質粒。含有結合位點的質粒為野生型(CYP19A1-WT-3′UTR)，將結合位點全部突變的質粒為突變型(CYP19A1-MUT-3′UTR)。轉染前1 d接種適量的293T細胞于48孔板，使轉染時細胞密度達到70%～80%，每組設置3個重復孔。共分為4組，野生型實驗組：CYP19A1-WT-3′UTR質粒+miR-1270 mimic；野生型對照組：CYP19A1-WT-3′UTR質粒+mimic NC；突變型實驗組：CYP19A1-MUT-3′UTR質粒+miR-1270 mimic；突變型對照組：CYP19A1-MUT-3′UTR質粒+mimic NC。按照lipofectamine2000說明書進行轉染，并于轉染后6～8 h更換新的培養液。轉染24 h后，按照雙熒光素酶報告試劑盒說明書使用酶標儀(BioTek，美國)檢測熒光素酶活性，結果以相對熒光素酶活性(螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶)表示。

6.蛋白質印跡實驗：miR-1270 mimic或inhibitor轉染48 h后，收集KGN細胞，用RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑(PMSF)在冰上裂解。每個蛋白質樣品用8%SDS-PAGE凝膠分離，然后轉移到PVDF膜上。室溫下用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉1.5 h，并與CYP19A1或β-actin(1∶1 000稀釋)一抗在4℃下培養過夜。然后用PBST清洗這些膜，并在室溫下與HRP標記的二抗(1∶2 000稀釋)孵育1.5 h。PBST清洗后，使用超敏化學發光液在VIBER Newton 7.0成像系統檢測條帶灰度。以β-actin灰度值作為內源性對照得到CYP19A1的相對表達量。

7.酶聯免疫吸附實驗：miR-1270 mimic或inhibitor轉染48 h后，收集KGN細胞的上清液，以1 000 r/min在4℃離心10 min后，將上清液收集后，按照酶聯免疫吸附測定試劑盒說明書，使用酶標儀檢測E2水平。

四、統計學分析

結果

一、不孕患者的一般資料和臨床特征

PCOS組不孕患者的竇卵泡數、BMI、AMH、LH、LH/FSH、PRL、T均顯著高于對照組(P<0.05)，FSH略低于對照組但尚無顯著性差異(P>0.05)；促排卵之后，PCOS組的獲卵數也顯著高于對照組(P<0.05)；但胚胎形成率組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。兩組間年齡、不孕年限、P、E2、FBG差異無統計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 PCOS和對照組不孕患者的一般資料和臨床特征比較(-±s)

二、生物信息學方法預測miR-1270靶基因

通過RNA22和RNAhybrid在線數據庫工具篩選出miR-1270的靶基因，取其交集共計9 282個基因(圖1)。在KEGG上富集信號通路，最終選擇卵巢類固醇生成途徑中的限速酶CYP19A1作為研究對象(圖2)。

三、miR-1270和CYP19A1在卵丘顆粒細胞中的表達水平

qRT-PCR檢測miR-1270和CYP19A1在PCOS患者卵丘顆粒細胞中的表達變化。統計結果顯示，與對照組相比，miR-1270在PCOS患者卵丘顆粒細胞中的表達量顯著降低(P<0.05)(圖3A)，而CYP19A1的表達量顯著上升(P<0.05)(圖3B)。

圖1 生物信息學工具(RNA22和RNAhybrid)預測miR-1270的候選靶基因

圖2 KEGG信號通路分析：CYP19A1參與的卵巢類固醇生成通路示意圖(來源：https://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway？157899344364697/hsa04913.args)

與對照組比較，*P<0.05圖3 miR-1270和CYP19A1在PCOS和對照組患者卵丘顆粒細胞中的表達水平比較

四、miR-1270通過靶向CYP19A1抑制KGN細胞E2合成

雙熒光素酶報告基因系統檢測發現miR-1270 mimic可顯著抑制CYP19A1野生型3′UTR報告載體的熒光素酶活性，而對突變型無明顯抑制作用(圖4A)。Western Blot分析發現CYP19A1的表達在miR-1270的過表達后顯著下調(P<0.05)(圖4B)。而抑制miR-1270可以在mRNA和蛋白質水平增強KGN細胞中CYP19A1的表達(P<0.05)(圖4C)。用miR-1270 mimic轉染KGN細胞可顯著減少E2的產生(P<0.05)；相反，miR-1270的抑制劑增強了KGN細胞培養基中E2的產生(P<0.05)(圖4D)。

A：模式圖顯示了熒光素酶報告基因中miR-1270與CYP19A1的預測結合位點，野生型或突變型結合位點以紅色字體表示。柱狀圖顯示野生型實驗組CYP19A1-WT-3′UTR質粒+miR-1270 mimic、野生型對照組CYP19A1-WT-3′UTR質粒+mimic NC、突變型實驗組CYP19A1-MUT-3′UTR質粒+miR-1270 mimic和突變型對照組CYP19A1-MUT-3′UTR質粒+mimic NC熒光素酶相對表達量(CYP19A1-WT-3′UTR質粒+miR-1270 mimic與CYP19A1-WT-3′UTR質粒+mimic NC比較，*P<0.05)。B～D：分別用Western blot實驗、qRT-PCR實驗、ELISA實驗檢測轉染miR-1270 mimic或inhibitor后CYP19A1的蛋白水平、mRNA水平和終產物E2的水平。與同組中對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖4 miR-1270通過靶向結合CYP19A1抑制KGN細胞E2合成

討論

PCOS是育齡期女性常見的內分泌性疾病，主要的臨床表現為高雄激素血癥、月經異常、肥胖和不孕。而引起不孕的主要原因是卵泡發育障礙，其卵泡發育停滯在竇狀卵泡階段[15-16]。近年來的研究發現，非編碼RNA在多種疾病中均有參與。其中的miRNA是一種保守的、內源性的、非編碼的、小的單鏈RNA分子，在細胞各個功能中起著重要的調控作用[17]，如凋亡、增殖和信號轉導。miRNAs可以選擇性地分泌到血液、血漿或血清甚至卵泡液中，并被認為是治療的靶點或不同疾病診斷的生物標志物[18]。比如miR-143-3p通過靶向KLF5并失活Wnt/β-catenin途徑抑制人牙周膜細胞的成骨分化[19]；miR-146a-5p可以抑制壞死性小腸結腸炎(NEC)中的NLRP3下游炎性因子和CLIC4的表達進而減輕NEC引起的腸道炎癥和腸道損傷[20]。

近年來許多研究發現，miRNA在PCOS患者的卵泡液[21-22]、卵丘顆粒細胞[23]甚至血液[24-25]里異常表達，并且通過調節細胞增殖、凋亡、激素的生物合成和分泌參與PCOS的發病過程。近期研究表明，miRNA能夠通過靶向結合多種下游mRNA，調控激素合成[26-27]，進而影響卵泡發育。比如lncRNA ZFAS1/miR-129/HMGB1軸和lncRNA PVT1/miRNA-17-5p/PTEN軸都能抑制PCOS顆粒細胞凋亡并促進E2和孕激素(P4)的分泌，進而影響PCOS的卵泡發育[28-29]；miR-155可以作為血液標志物監測PCOS高雄激素血癥和抗雄激素的治療效果[30]。

本研究通過qRT-PCR及后續的轉染實驗，首次揭示了PCOS患者卵丘顆粒細胞中miR-1270及其靶基因CYP19A1的表達及作用。首先通過生物信息學預測和雙熒光素酶報告基因實驗，找到與卵巢類固醇生成通路有關的miR-1270靶基因，預測信息和實驗結果均證實CYP19A1是miR-1270的靶基因。同時，實驗表明，與對照組相比，PCOS組患者卵丘顆粒細胞中miR-1270表達量顯著降低，而CYP19A1的表達量顯著增高。進一步用qRT-PCR和Western blot在KGN細胞系進行功能驗證，發現CYP19A1的表達受miR-1270的影響，miR-1270過表達時CYP19A1的表達受到抑制，而敲低miR-1270時則相反。進一步采用ELISA對miR-1270是否影響CYP19A1的終產物E2進行驗證，發現上調miR-1270能夠使KGN分泌E2的能力降低，進一步證實miR-1270能夠靶向結合CYP19A1抑制E2合成。

有研究證明，類固醇激素生成酶，如CYP11A1、CYP19A1和3β-HSD，在PCOS小鼠的顆粒細胞中增加，同時伴隨E2和P的增加[31]。P450scc、3β-HSD、P450arom(CYP19A1)在PCOS婦女多囊卵巢和其他動物模型中的表達也較高[32-33]。CYP19可能作為PCOS表型的遺傳修飾物[34]。已有研究表明雌激素是卵巢甾體生成途徑的最終產物，因此芳香化酶可以作為選擇性抑制的靶點。芳香化酶抑制劑，如來曲唑，在臨床上廣泛應用于PCOS排卵誘導[12]。來曲唑治療后E2水平和芳香化酶活性顯著降低[35]，此外，沒有證據表明終產物E2對CYP19A1有抑制作用[36]。來曲唑治療PCOS的作用機制可能是通過抑制芳香化酶抑制雌激素的分泌，進一步減弱雌激素對下丘腦/垂體軸的負反饋作用，促性腺激素分泌增加刺激FSH生物合成[12，37-38]。FSH促進芳香化酶表達，然后顯著加速卵泡發育[39-40]，但具體的分子機制尚不明確。PCOS不孕患者伴隨miR-1270降低，減少靶向調控CYP19A1的作用，促進芳香化酶的產生，進而增加雌激素的合成，影響PCOS卵泡的發育(圖5)。本研究為芳香化酶抑制劑的臨床應用提供了新的分子理論依據。