缺氧對人前列腺癌細胞PC3和LNCaP生物學特性的影響

郭愛鑫，楊麗雅，周曉光，何佳璘，郭一鳴，王慧萍*，宋黎明*

(1.北京協和醫學院研究生院，北京 100730；2.國家衛生健康委科學技術研究所，北京 100081；3.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院，北京 100020)

前列腺癌(prostate cancer)是男性生殖系統最常見的惡性腫瘤，發病率高居第2位，僅次于肺癌[1-2]。近20年來隨著人口老齡化及生活條件的改善，我國前列腺癌發病率也逐年增加[3]。前列腺癌確診時多為晚期[4]，臨床應用去勢療法后易產生耐藥而轉化為去勢抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)，患者的生存期大大縮短[5]。有證據表明缺氧是許多實體腫瘤微環境改變的主要特征，腫瘤局部缺氧是造成其轉移的重要因素之一[6-9]。因此，本研究通過檢測缺氧微環境對人源雄激素非依賴性前列腺癌細胞系PC3和人源雄激素依賴性前列腺癌細胞系LNCaP增殖、轉移、侵襲變化的影響，以期深入了解缺氧微環境對前列腺癌惡性生長作用的相關機制，為臨床診療及相關研究提供思路。

材料與方法

一、研究材料

1.實驗細胞來源：人源雄激素非依賴性前列腺癌細胞系PC3(編號：3111C0001CCC000115)和人源雄激素依賴性前列腺癌細胞系LNCaP(編號：3111C0001CCC000040)均購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心，本實驗室常規傳代培養、凍存。

2.主要試劑：兔抗人E鈣粘蛋白(E-cadherin)單克隆抗體(3195T)、兔抗人波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體(5741T)購自美國CST公司，E-cadherin、Vimentin正反引物購自華大基因，BCA蛋白濃度試劑盒、凝膠試劑盒及結晶紫染色液購自北京索萊寶公司，cDNA第一鏈合成試劑盒和SuperReal 熒光定量預混試劑購自天根公司，Transwell小室和Matrigal基質膠購自美國康寧公司，Trizol裂解液購自美國Invitrogen公司。

二、研究方法

1.實驗分組：兩種前列腺癌細胞分別進行常氧和缺氧培養，常氧組放置于普通培養箱，培養條件為21%O2、5%CO2和74%N2。缺氧組細胞放置于缺氧培養箱，培養條件為1%O2、5%CO2和94%N2。常氧組和缺氧組細胞按照實驗需要選擇不同時間培養后行后續實驗檢測。

2.細胞增殖檢測試劑盒(CCK-8)檢測細胞增殖情況：選擇對數生長期細胞，制備細胞懸液(6～8×103個/100 μl)均勻接種入96孔板中。將常氧組和缺氧組細胞放于不同培養箱分別孵育不同時間(0、4、8、12、16、20、24、48、72 h)，每組設置3個復孔。孵育不同時間后每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續分別在常、缺氧培養箱內孵育(PC3細胞繼續孵育4 h，LNCaP細胞繼續孵育1 h)。酶標儀測定450 nm處的吸光度(A值)，計算各個時間點的相對增殖情況。相對細胞增殖率=[(實驗孔吸光度-空白孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%。實驗重復3次。

3.實時熒光定量PCR(qRT-PCR)實驗：培養細胞加入0.25%胰酶消化后，2 000g離心得細胞沉淀(1.5×106個)，加入1 ml Trizol提取總RNA，使用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉錄，獲取cDNA。E-cadherin 引物(5′-ATTCTGATTCTGCTGCTCTTG-3′，5′-AGTCCTGGTCCTCTTCTCC-3′)、Vimentin引物(5′-AATGACCGCTTCGCCAAC-3′，5′-CCGCATCTCCTCCTCGTAG-3′)和內參蛋白β-actin引物(5′-TGTGATGGTGGGAATGGGTCA-3′，5′-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3′)。使用SuperReal熒光定量預混試劑(SYBR Green)進行Real-Time PCR反應，按照說明書配置20 μl體系，上機設備ABI 7500，40個循環后采用2-△△Ct法計算結果。

4.蛋白印跡(Western blotting)實驗：同方法3中獲得細胞沉淀，利用100 μl含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法蛋白定量后分裝、-70℃保存。取上述提取液(含蛋白約30 μg)進行10% SDS-PAGE電泳(電泳條件為70 V 20 min，110 V 1 h)。將電泳分離后的蛋白質轉移至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉封閉30 min、TBST洗脫后分別加入封閉液稀釋的E-cadherin兔抗人抗體(1∶1 000稀釋)、Vimentin兔抗人抗體(1∶1 000)及β-actin單克隆抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜。洗膜后加入相應的HRP標記山羊抗小鼠IgG或HRP標記山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h后洗膜。膜抗原-抗體復合物用ECL法染色顯示，GE Healthcare凝膠成像系統進行檢測分析。

5.細胞劃痕實驗：根據前面的細胞增殖實驗情況，PC3細胞分別缺氧培養0、8和24 h，LNCaP細胞分別缺氧培養0、24和48 h觀察腫瘤細胞的遷移能力變化。收集各組細胞以3×105/孔接種至6孔板。細胞匯合度接近100%時，用200 μl槍頭在6孔板內畫橫豎兩條直線，寬度保持一致，PBS洗3次，清除漂浮細胞，加入無血清或含5%血清的培養基，放入缺氧培養箱中培養，于40倍倒置顯微鏡下觀察，并分別于一定時間后在同一部位拍照。計算劃痕愈合率即遷移率，劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%，實驗重復3次。

6.Transwell實驗：預先用無血清RMPI-1640培養基將50 mg/L的人工基底膜(Matrigel)1∶10稀釋后，包被Transwell小室底部膜，37℃風干過夜，水化基底膜，于37℃放置2 h后置于24孔板中。將各組細胞消化制成細胞懸液，將含1×105細胞的200 μl懸液加入上室，下室加入750 μl含10% FBS的RMPI-1640培養基，每組設3個復孔，放入37℃、5%CO2、1%O2、94%N2飽和濕度環境的溫育箱中培養，分別在24和48 h后取出小室，吸棄上室培養基，用棉簽輕拭去上室細胞，4%多聚甲醛固定15 min，結晶紫染色10 min，PBS洗滌3次，于100倍倒置顯微鏡下隨機選取5個視野拍照計數。培養24和48 h后計數下室和上室細胞數，計算侵襲率[下室細胞數/(上室細胞數+下室細胞數)×100%]。

三、統計學方法

結 果

一、不同缺氧時間培養后PC3和LNCaP細胞的增殖情況

采用CCK-8法檢測細胞的增殖能力，本實驗用同一時間點缺氧與常氧的相對增殖率與0 h時兩組的相對增殖率比較來表示每一時間點的細胞增殖活性。實驗結果顯示，與其他時間點比較，PC3細胞在缺氧4 h時增殖活性最高(P<0.05)，為0 h時的2.95倍；4 h后增殖活性開始下降，20 h降至最低，為0 h組的0.96倍(P<0.05)；20 h后增殖活性又開始上升，48 h細胞增殖活性是0 h的1.95倍(圖1A)。

LNCaP細胞在缺氧培養0～16 h時間段增殖活性逐漸升高，16 h時達最高，為0 h時的4.76倍(P<0.05)；16 h后增殖活性降低，48 h和72 h分別為0 h時的0.97和0.84倍，差異均有統計學意義(P<0.05)(圖1B)。

注：與其他組比較，*P<0.05圖1 PC3與LNCaP細胞在缺氧不同時間點的增殖活性變化

二、不同缺氧時間培養后PC3和LNCaP細胞中E-cadherin和Vimentin的mRNA表達變化

采用RQ表示mRNA 相對表達量(RQ=2-△△Ct)。PCR結果顯示，在PC3細胞中，缺氧8 h時E-cadherin的mRNA表達水平顯著高于0 h時的表達水平(RQ=1.38，P<0.05)，然后表達呈降低趨勢，在48 h時表達最低(RQ=0.21，P<0.05)(圖2A)。對LNCaP細胞而言，不同時間的缺氧培養E-cadherin的mRNA表達水平均顯著下降(P<0.01)，在72 h時E-cadherin的mRNA相對表達量最低(RQ=0.31，P<0.05)(圖2B)。

Vimentin的mRNA表達情況與E-cadherin不同。PC3細胞中，Vimentin的mRNA表達隨缺氧時間延長而增強(P<0.05)，并在72 h時達到最高(RQ=2.31，P<0.05)(圖3A)。LNCaP細胞中，Vimentin的mRNA表達同樣隨缺氧時間延長而增強(P<0.01)，在48 h時達到最高(RQ=58，P<0.01)，72 h時表達量則出現了下降(RQ=42，P<0.05)(圖3B)。

注：與0 h組比較，*P<0.05；與其他組比較，**P<0.01，#P<0.05；RQ=2-△△Ct圖2 PC3與LNCaP細胞在缺氧不同時間點E-cadherin的mRNA表達水平變化

三、不同缺氧時間培養后前列腺癌PC3和LNCaP細胞中E-cadherin和Vimentin蛋白水平表達變化

由于PC3細胞E-cadherin的mRNA水平在48 h內變化差異較大(圖2A)，因此檢測其蛋白水平時根據預實驗增加4 h、12 h、16 h時間點以便更清晰觀察。采用目標蛋白與內參歸一化后的相對值RW來表示蛋白相對表達量，結果發現，兩種細胞系在缺氧不同時間點E-cadherin蛋白表達水平均顯著低于0 h時的蛋白水平(P<0.01)。其中PC3細胞在48 h時蛋白表達最低(RW=0.43，P<0.05)(圖4A)；而LNCaP細胞在72 h時表達最低(RW=0.37，P<0.05)(圖4B)。

檢測Vimentin的蛋白表達水平顯示，PC3細胞的各缺氧時間點(4 h除外)及LNCaP細胞的各缺氧時間點的蛋白表達水平均顯著高于0 h組(P<0.01)，PC3細胞在48 h時表達最高(RW=2.64，P<0.05)(圖5A)，LNCaP細胞在72 h時表達最高(RW=5.63，P<0.05)(圖5B)。

注：與其他組比較，**P<0.01，*P<0.05；RW是目標分子與內參歸一化后的相對值圖5 PC3與LNCaP細胞在缺氧不同時間點Vimentin的蛋白表達情況

四、前列腺癌細胞PC3和LNCaP不同缺氧時間培養后的細胞遷移率變化

細胞劃痕實驗結果顯示，PC3細胞缺氧8 h時，其劃痕面積顯著小于常氧組，遷移率顯著上升[(30.14±1.26)% vs.(18.26±0.84)%](P<0.01)；缺氧24 h時，劃痕面積進一步縮小，且同樣小于常氧組，遷移率顯著上升[(47.65±1.56)% vs.(32.49±2.46)%](P<0.01)(圖6)。

LNCaP細胞缺氧24 h時，其劃痕面積也顯著小于常氧組，遷移率顯著上升[(32.92±1.94)% vs.(19.18±0.55)%](P<0.01)；缺氧48 h時，劃痕面積同樣進一步縮小，且小于常氧組，遷移率顯著上升[(56.14±0.72)% vs.(45.12±2.01)%](P<0.01)；因LNCaP細胞缺氧培養8 h組遷移率與對照組無顯著差別，因此延長了觀察時間即增加48 h時間點檢測(圖7)。

注：與同時間點的常氧組比較，**P<0.01圖6 前列腺癌PC3細胞不同缺氧時間點的細胞遷移情況

注：與同時間點的常氧組比較，**P<0.0圖7 前列腺癌LNCaP細胞不同缺氧時間點的細胞遷移情況

五、前列腺癌細胞PC3和LNCaP不同缺氧時間培養后的細胞侵襲情況

根據穿過基底膜的細胞數作圖統計，結果顯示，PC3細胞缺氧8 h時[(14 835.25±271.84)vs.(10 868.18±344.31)個]和24 h時[(23 848.06±664.43)vs.(19 091.34±521.32)個]穿過基底膜細胞數量均顯著多于常氧組，侵襲能力顯著增強(P<0.01)(圖8)。

A：細胞結晶紫染色，×200；B：細胞計數統計圖：與同時間點的常氧組比較，**P<0.01圖8 前列腺癌PC3細胞的Transwell實驗結果

LNCaP細胞缺氧24 h時[(11 852.19±453.71)vs.(7 697.48±158.32)]和48 h時[(24 187.26±529.84)vs.(18 432.37±234.46)]穿過基底膜細胞數量也均顯著多于常氧組(P<0.01)，侵襲能力顯著增強；與劃痕實驗相同，LNCaP細胞延長觀察時間，增加48 h時間點檢測(圖9)。

A：細胞結晶紫染色，×200；B：細胞計數統計圖：與同時間點的常氧組比較，**P<0.01，***P<0.001圖9 前列腺癌LNCaP細胞的Transwell實驗結果

討 論

據統計2018年全球有近130萬前列腺癌新發病例和35.9萬死亡病例，占男性惡性腫瘤發病率的13.5%；占男性惡性腫瘤死亡率的6.7%，高居第5位。目前臨床常用的去勢療法總有效率為70%～80%，但治療18～24個月后易復發轉化為CRPC，CRPC患者的中位生存期只有1～2年。

前列腺癌的發生發展是一個多階段、涉及多基因改變的復雜過程，即由正常上皮轉化為上皮過度增生，增生發生變異并演進至癌及侵潤與轉移[10]。有研究表明，前列腺癌的生物學行為如增殖分裂、侵襲及轉移等，除了與遺傳易感性相關外，還依賴于特定的細胞因子及其相關的微環境，其中缺氧微環境引起了更多關注[6-7]。在腫瘤組織中，因為細胞快速且無限制的增殖分裂，會出現局部組織缺氧，適應缺氧并存活下來的細胞進而繼續增殖、遷移侵襲和浸潤到其他細胞，最終導致癌癥的發生發展。迄今為止，缺氧對晚期前列腺癌惡性生長的影響機理尚未明確，但缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor 1，HIF-1α)在其中扮演著重要的角色[6-7]。本課題組前期研究結果發現常氧狀態下晚期前列腺癌的惡性生長依賴于新生血管生成和PI3K/AKT信號通路[11-12]，而上述效應和通路與HIF-1α密切相關，因此我們推測缺氧可能促進晚期前列腺癌的惡性增殖與遷移。本實驗主要觀察體外前列腺癌細胞在不同缺氧時間導致的低氧微環境下所發生的動態變化，為進一步闡明低氧與晚期腫瘤細胞的侵襲轉移提供新的思路。

去勢治療對早期雄激素依賴性的前列腺癌細胞起到了良好效果，但轉化成CRPC后，腫瘤細胞在缺乏雄激素的狀態下依舊能很好地生長[13-14]。因此，本文選用雄激素依賴性前列腺癌細胞系LNCaP和雄激素非依賴性前列腺癌細胞系PC3來觀察其惡性生長的特性。

從細胞增殖實驗可以看出兩種前列腺癌細胞增殖活性隨著缺氧時間的增加不斷反復變化。在缺氧0～20 h時腫瘤細胞增殖活性顯著升高(P<0.05)，但期間也有升高和降低的波動，提示缺氧時前列腺癌細胞的增殖是一個動態變化的過程。推測缺氧初期，細胞密度急劇上升發生接觸抑制，細胞的增殖速率有所下降，相關基因級聯調控使前列腺癌細胞對缺氧做出應激反應，癌細胞增殖能力、侵襲轉移能力增強，癌細胞發生轉移，細胞密度下降。細胞增殖曲線同樣提示一定程度的缺氧可代償性增強細胞的增殖能力，但隨缺氧時間的延長反而起到抑制的作用(LNCaP細胞在缺氧48和72 h時存活率顯著低于常氧組)，確切機理尚需要進一步實驗研究。

缺氧微環境會促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。本研究通過細胞劃痕和Transwell實驗也發現在不同缺氧時間下兩種前列腺癌細胞的遷移速率加快、穿透基底膜數量增加，證實缺氧促進了腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。但同等條件(起始細胞量相同和缺氧時間24 h時)下PC3細胞遷移侵襲速率大于LNCaP細胞，表明PC3細胞惡性程度要高于LNCaP細胞。本研究同時發現LNCaP細胞之間更具有粘附性，常多個細胞粘連成團導致細胞不易移動，轉移和侵襲能力較弱。而雄激素非依賴性前列腺癌PC3細胞生長形態為典型的長梭形，細胞獨立生長不發生粘連，這種形態學特點使其更具侵襲性。從細胞劃痕和侵襲實驗也可以看出LNCaP細胞遷移速度緩慢，貼壁不牢固，侵襲能力較弱，因此適當延長時間到48 h作為觀察點。PC3細胞在同等條件下遷移速率快，侵襲能力強而對人體更具有威脅性，也提示CRPC是臨床上治療的難點和研究重點。

很多研究發現腫瘤細胞包括前列腺癌細胞的轉移總是伴隨上皮間充質轉化(epithelial-mesenchyme transformation，EMT)的轉變[15-16]，其主要的特征有細胞黏附分子(如E-cadherin)表達的減少、角蛋白細胞骨架轉化為以Vimentin為主的細胞骨架，從而獲得間充質細胞特性。E-cadherin是典型的上皮細胞特異性標志物，可介導細胞之間互相粘附，調節正常細胞間連結的形成和維護[17-18]。Vimentin對于維持正常細胞的結構完整性和上皮到間質過渡非常重要，有助于轉移性癌細胞的侵入性表型轉化[19-20]。在EMT過程中，癌細胞脫去上皮細胞的某些特性，如細胞間的黏附性、細胞極性，發生細胞骨架改變，向間充質表型轉變并獲得高度的運動性和侵襲性。由于CCK-8實驗發現缺氧對細胞的增殖是一個隨時間變化的動態過程，因此，我們觀察了不同缺氧時間處理下前列腺癌細胞這兩個重要分子的mRNA和蛋白表達水平以判斷是否發生EMT以及EMT過程是否也隨缺氧時間變化。實驗發現無論在mRNA水平還是蛋白水平隨著缺氧時間的增加兩種前列腺癌細胞E-cadherin的表達量均逐漸減少(P<0.05)，而Vimentin表達量逐漸增多(P<0.05)，表明缺氧狀態下前列腺癌細胞發生典型的EMT。但這種轉化是實時動態變化的，提示缺氧下的EMT轉化可能是一個可逆的動態變化的過程，具體機理需進一步實驗研究。

綜上所述，本文通過模擬體內缺氧微環境觀察缺氧對前列腺癌兩種細胞系惡性生長的影響，表明一定程度的缺氧不僅能夠增強前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并且能夠誘導EMT發生；同時發現缺氧促進癌細胞惡性生長是一個動態變化的過程。缺氧總體上有促進前列腺癌惡性生長的趨勢，但在個別時間點也會出現抑制的情況，說明即使E-cadherin等分子在晚期腫瘤惡性生長中起到關鍵作用但仍不能作為治療和觀察預后的單一靶標，這為研究針對缺氧動態變化的抗晚期前列腺癌研究提供了實驗基礎。