血管介入法構建兔對比劑急性腎損傷模型的氧化應激和病理學改變

王征宇， 相建峰， 彭志清， 陳 亮， 李萬斌， 王永利

隨著介入診療技術發展，碘對比劑更多地應用于血管內診治， 從而導致對比劑急性腎損傷（contrast-induced acute kidney injury，CI-AKI）發生。目前認為CI-AKI 發病機制主要與腎血管收縮引起的腎缺血、腎小管直接毒性和腎小管細胞氧化應激反應等因素有關［1-2］，但現有研究仍不能完全明確其發病機制和病理變化。 本研究通過血管介入技術構建兔CI-AKI 模型，旨在觀察評估其腎功能改變、氧化應激反應、腎組織病理變化及其相關性，為臨床防治CI-AKI 提供實驗證據支持。

1 材料與方法

1.1 實驗器械和試劑

4F 導管鞘（日本Terumo 公司），碘海醇（300mgI/mL，美國GE 公司），血清肌酐（sCr）和血清尿素氮（BUN）測試試劑盒（Olympus Diagnostica 愛爾蘭公司），丙二醛（MDA）、髓過氧化物酶（MPO）、細胞總抗氧化能力（TAC）、過氧化氫酶（CAT）及總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 實驗動物

12 只健康、清潔、雄性新西蘭大白兔，2～3 個月齡，體重約2 500 g（由上海奉賢輝煌養殖場購入），予1 周適應性分籠飼養，每籠1 只，提供足量飲水、標準兔食。 飼養環境良好，室溫20～25℃，相對濕度為45%～65%。 本實驗經醫院倫理委員會批準，符合動物倫理要求。

1.3 兔CI-AKI 模型構建

將實驗兔隨機分為4 組：12 h CI-AKI 組（n=3）、24 h CI-AKI 組（n=3）、48 h CI-AKI 組（n=3）和對照組（n=3），均在AXIOM Artis dTA DSA 系統（德國Siemens 公司）下進行血管內介入手術造模。 經兔耳緣靜脈注射1.5%戊巴比妥鈉（1 mL/kg，初次劑量5 mL，隨后根據情況追加劑量）麻醉后，將兔置于導管床，鈍性分離左頸總動脈，采用改良Seldinger 技術逆行穿刺左頸總動脈成功后， 經導絲引入4 F 導管鞘中擴張管作為血管內導管， 頭端位于腹主動脈上段，注入1～2 mL 碘海醇確認雙腎動脈和腎實質顯影，將導管固定； 各CI-AKI 組經導管持續注入碘海醇，劑量為14 g/kg，總量約120 mL，對照組注入等量0.9%氯化鈉注射液，灌注時間均為30 min；灌注完畢拔除導管并結扎此頸總動脈， 局部縫合包扎，常規喂養。

1.4 血液學和組織學標本獲取

分別于術前1 h，術后1 h、2 h、12 h、24 h（24 h、48 h CI-AKI 組和對照組）和48 h（48 h CI-AKI 組和對照組）經兔耳靜脈抽血10 mL，用于腎功能和氧化應激反應檢測。 分別于術后12 h（12 h CI-AKI 組）、24 h（24 h CI-AKI 組）、48 h（48 h CI-AKI 組和對照組），5%戊巴比妥鈉經兔耳緣靜脈注射（5 mL/只）致安樂死，立即稱重并取下雙腎，左腎用于病理學檢查，右腎分離皮、髓質后用于腎組織勻漿檢測。

1.5 實驗室檢查和組織病理學檢查

根據試劑盒說明進行sCr 和BUN 檢測， 同時檢測血液和腎皮質、髓質勻漿中MDA、MPO、TAC、CAT、T-SOD。

將各組兔腎臟標本制成光鏡病理切片，分別采用蘇木精-伊紅（HE）、高碘酸-無色品紅（PAS）、過碘酸六胺銀（PASM）和Masson 染色法染色后進行光鏡病理學檢查。 取48 h CI-AKI 組2 只和對照組1只兔腎臟標本，制作電鏡病理切片，采用鈾鉛雙染色后進行觀察。光鏡下對腎損傷病理變化程度進行分級：0 級，無損傷；1 級，輕度損傷（＜25%）；2 級，中度損傷（25%～＜50%）；3 級，嚴重損傷（50%～75%）；4 級：非常嚴重損傷（＞75%）［3］。 資料采集和分析均由2 名有經驗的專業病理醫師通過盲法進行。

1.6 統計學方法

采用SPSS 24.0 軟件對所有數據進行統計學分析。 均數±標準差（±s）描述正態分布的定量資料，單因素方差分析比較各時間點組間各標記物差異，組間差異有統計學意義的用LSD-t檢驗行兩兩比較，獨立樣本t檢驗比較兩組間定量資料分布差異，配對樣本t檢驗比較各組術后各時間點各標記物與術前的差異，Pearson 相關分析比較各標記物間相關性，Spearman 相關分析比較病理損傷與各標記物間相關性，Kruskal-Wallis H 檢驗比較組間腎組織病理損傷程度差異， 組間差異有統計學意義的用Mann-Whitney U 檢驗進行兩兩比較。 本研究所有檢驗均為雙側檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物一般情況

術后兔在籠中自然蘇醒，無死亡，活動自如，各CI-AKI 組兔精神萎靡，飲水和進食較術前減少1/4～1/2，對照組兔精神狀態無明顯變化，飲水和進食與術前基本一致。 術前各CI-AKI 組與對照組體重差異無統計學意義（t=-0.366，P=0.722），術后各CI-AKI組體重較術前減輕，顯著低于對照組（t=-2.457，P=0.034），其中48 h CI-AKI 組術后體重較術前減輕，差異有統計學意義（t=5.500，P=0.032）。

2.2 手術前后腎功能變化

術前各CI-AKI 組sCr 和BUN 與對照組比較，差異無統計學意義（t=0.512，P=0.620）。 各CI-AKI組術后1 h 時sCr 均顯著升高且高于對照組（P＜0.05），12 h 時升高均＞25%（表1）；BUN 高于對照組（P＜0.05）， 其中12 h CI-AKI 組、48 h CI-AKI 組術后BUN 均高于術前12 h CI-AKI 組。

表1 手術前后sCr 變化 μmol/L，±s

表1 手術前后sCr 變化 μmol/L，±s

*與術前比較，P＜0.05

組別 術前 術后1 h 術后2 h 術后12 h 術后24 h 術后48 h 12 h CI-AKI 組（n=3） 80.00±5.57 105.67±14.01* 116.33±19.66* 148.33±14.98* — —24 h CI-AKI 組（n=3） 85.33±3.51 93.33±5.86* 104.00±7.21* 121.00±10.15* 137.00±11.14* —48 h CI-AKI 組（n=3） 89.00±5.20 98.67±5.03* 111.33±10.69 122.33±12.42* 135.33±17.62* 162.00±5.00*CI-AKI 組整體 84.78±5.74* 99.22±9.63* 110.56±12.92* 130.56±17.28* 136.17±13.21* 162.00±5.00*對照組（n=3） 83.00±2.00 83.00±3.00 85.33±2.52 80.33±2.52 82.33±2.08 82.00±2.65 t 值 0.512 2.792 5.548 4.862 6.784 24.495 P 值 0.620 0.019 ＜0.001 0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 手術前后血清和腎組織氧化應激反應標記物變化

各CI-AKI 組血清MDA 術后1 h 較術前有所降低，術后2 h 后開始升高；血清MPO 術后1 h 即開始明顯升高； 血清TAC、CAT、T-SOD 術后1 h 即開始下降。 24 h CI-AKI 組、48 h CI-AKI 組術后血清MDA， 各CI-AKI 組術后MPO 均高于術前及對照組（P＜0.05）；12 h CI-AKI 組術后血清TAC， 各CI-AKI組術后血清CAT、T-SOD 均低于術前（P＜0.05），其中CAT 低于對照組（P＜0.05）。對照組術后各標記物與術前差異無統計學意義（P＞0.05）。各CI-AKI 組腎皮質和髓質勻漿MDA、MPO 均較對照組增高，TAC、CAT、T-SOD 均下降， 其中24 h CI-AKI 組、48 h CI-AKI 組MPO 均高于對照組（P＜0.05），各CI-AKI組腎髓質勻漿各標記物與對照組差異均無統計學意義（P＞0.05）。 表2～5。

2.4 sCr、BUN 與氧化應激反應標記物變化相關性

sCr 與BUN，血清MDA、MPO，腎皮質MPO，腎髓質MDA、MPO 呈正相關，與腎髓質T-SOD 呈負相關；BUN 與血清MDA、MPO 呈正相關， 與血清T-SOD 呈負相關。

2.5 術后腎組織病理改變

腎組織病理學檢查結果顯示， 各CI-AKI 組有嚴重的皮質、髓質近端腎小管損傷、較輕的皮質遠端腎小管損傷及輕度的腎小球損傷；對照組僅有輕度病理學改變，見圖1。 皮質、髓質近端腎小管損傷，各組間差異有統計學意義（χ2=9.680，P=0.021；χ2=10.866，P=0.012）， 各CI-AKI 組損傷均高于對照組（P＜0.05）。皮質近端腎小管損傷與sCr，血清MDA、MPO，皮質MPO，髓質MDA、MPO 呈正相關，與血清CAT、髓質T-SOD 呈負相關。 髓質近端腎小管損傷與sCr，血清MDA、MPO，皮質MPO，髓質MDA 呈正相關，與血清、髓質T-SOD 呈負相關。

表2 手術前后血清MDA 變化 nmol/mL，±s

表2 手術前后血清MDA 變化 nmol/mL，±s

*與術前比較，P＜0.05

組別 術前 術后1 h 術后2 h 術后12 h 術后24 h 術后48 h 12 h CI-AKI 組（n=3） 2.24±0.07 1.93±0.23 3.39±1.17 5.14±1.32 — —24 h CI-AKI 組（n=3） 3.56±0.81 2.97±0.29 4.12±0.97 5.11±1.33* 5.50±0.84* —48 h CI-AKI 組（n=3） 3.10±0.95 2.88±1.18 3.60±1.44 4.63±0.65* 5.32±1.02 5.45±0.65*CI-AKI 組整體 2.97±0.85 2.59±0.79 3.70±1.10 4.96±1.02 5.41±0.84 5.45±0.65對照組（n=3） 2.75±0.92 2.85±0.77 2.75±0.35 2.45±1.13 2.45±0.90 3.25±0.57 t 值 0.385 -0.494 2.291 3.601 4.876 4.393 P 值 0.708 0.632 0.045 0.005 0.002 0.012

表3 手術前后血清MPO 變化 U/L，±s

表3 手術前后血清MPO 變化 U/L，±s

*與術前比較，P＜0.05

組別 術前 術后1 h 術后2 h 術后12 h 術后24 h 術后48 h 12 h CI-AKI 組（n=3） 38.94±3.79 46.20±1.32* 52.05±6.65 66.10±13.22 — —24 h CI-AKI 組（n=3） 29.28±5.49 40.64±4.09 44.82±3.33 63.25±8.60* 66.21±3.00* —48 h CI-AKI 組（n=3） 39.25±5.94 49.82±17.63 49.58±19.16 63.59±9.29* 65.13±6.44* 79.05±2.30*CI-AKI 組整體 35.82±6.64 45.55±9.92 48.82±10.76 64.31±9.25 65.67±4.53 79.05±2.30對照組（n=3） 43.66±8.31 32.13±11.16 41.96±20.16 45.23±8.57 48.45±10.83 49.16±5.20 t 值 -1.680 1.978 0.779 3.139 3.509 9.098 P 值 0.124 0.076 0.454 0.011 0.010 0.001

表4 手術前后血清CAT 變化 U/mL，±s

表4 手術前后血清CAT 變化 U/mL，±s

*與術前比較，P＜0.05

組別 術前 術后1 h 術后2 h 術后12 h 術后24 h 術后48 h 12 h CI-AKI 組（n=3） 10.81±1.01 6.90±2.94 5.61±2.64* 3.49±0.64* — —24 h CI-AKI 組（n=3） 4.74±2.17 2.74±2.04* 2.55±2.08* 0.79±0.42 0.54±0.09 —48 h CI-AKI 組（n=3） 11.16±3.13 9.50±2.90* 8.03±2.10* 6.65±0.96 4.29±0.71 3.42±1.06 CI-AKI 組整體 8.90±3.69 6.38±3.74 5.40±3.09 3.64±2.61 2.42±2.10 3.42±1.06對照組（n=3） 4.34±1.24 6.39±2.63 8.68±2.88 8.16±0.84 6.56±2.13 5.28±0.24 t 值 2.044 -0.004 -1.615 -2.863 -2.774 -2.962 P 值 0.068 0.997 0.137 0.017 0.028 0.087

表5 手術前后血清T-SOD 變化 U/mL，±s

表5 手術前后血清T-SOD 變化 U/mL，±s

*與術前比較，P＜0.05

組別 術前 術后1 h 術后2 h 術后12 h 術后24 h 術后48 h 12 h CI-AKI 組（n=3） 457.02±21.84 401.89±16.90* 322.83±85.38 257.33±62.80* — —24 h CI-AKI 組（n=3） 533.60±36.09 501.45±36.90* 460.78±15.37* 444.79±37.97 413.33±14.69 —48 h CI-AKI 組（n=3） 510.87±42.85 485.86±52.76* 469.55±50.67* 462.90±53.45* 430.80±80.62 417.50±71.10*CI-AKI 組整體 500.50±45.43 463.07±57.08 417.72±87.19 388.34±108.52 422.07±52.70 417.50±71.10對照組（n=3） 477.57±8.80 468.94±27.82 489.43±29.33 471.96±40.94 463.54±16.11 501.28±37.45 t 值 1.435 -0.168 -1.360 -1.270 -1.293 -1.806 P 值 0.184 0.870 0.204 0.233 0.237 0.145

3 討論

目前文獻報道的CI-AKI 動物實驗多來自大鼠模型，但在嚙齒類動物中，兔腎臟形態學表現與人體更接近［3］。 據文獻報道，單次注射含碘對比劑5 g/kg即可在兔體內誘導CI-AKI 發生， 而在大鼠和小鼠體內卻不會引起明顯腎損傷［4-5］，因此兔更適合構建CI-AKI 模型［6］。 既往研究中基本采用外周靜脈注射方式， 多聯合應用脫水或腎毒性藥物共同誘導CI-AKI 發生［7］，但不一定能真實反映經導管血管內治療中CI-AKI 發生情況及病理生理變化。 因此，本研究采用血管內介入技術制作兔CI-AKI 模型，經頸動脈入路操作較為簡便，且對比劑可隨血流方向進入雙側腎動脈，更容易造模成功。 由于目前尚無動物CI-AKI 診斷標準， 本研究參考了臨床最常用且比較公認的診斷標準： 應用對比劑48～72 h 內sCr 增加44 μmol/L 或較基礎值升高＞25%，并排除其他腎功能損害［8］。 本研究中各CI-AKI 組實驗兔在12 h 時sCr 水平均升高＞25%并具有統計學意義，且sCr 和BUN 變化水平顯著高于對照組；腎功能改變結合臨床表現證實，模型組兔在對比劑應用后12 h 均發生CI-AKI，表明血管介入技術可構建CI-AKI動物模型。

圖1 兔CI-AKI 模型構建后腎組織病理改變

MDA、MPO 作為氧化應激反應終產物， 過量生成會導致氧化性組織損傷，CAT、T-SOD 作為體內主要抗氧化酶，分解活性氧，避免自由基對人體細胞的氧化損傷，而TAC 可反映血漿和體內所有抗氧化劑總的作用［9-10］。本研究中各CI-AKI 組血清MDA 在術后1 h 有一過性下降， 提示氧化應激反應初期兔抗氧化能力較強，可抑制血清MDA 形成，但隨著氧自由基增加，氧化應激系統失代償，因而在2 h 開始明顯升高。MPO 升高和CAT、T-SOD、TAC 下降提示抗氧化酶過度消耗，兔總體抗氧化能力降低，結合腎組織勻漿標記物變化， 表明氧化應激反應發生，體內活性氧自由基過量產生導致腎損傷［10-11］。同時，各CI-AKI 組sCr、BUN 升高與氧化應激反應標記物變化顯著相關。 因此，氧化應激反應發生和加重與腎功能損害一致，即在血管介入診療中，強烈的氧化應激反應導致CI-AKI 發生。

藥物性腎損傷包括急性腎小管壞死和急性間質性腎炎，病理上主要表現為近端腎小管損傷和腎間質淋巴細胞、單核細胞、漿細胞等炎性細胞浸潤。本研究中兔CI-AKI 模型病理表現為皮質和髓質近端腎小管損傷、 皮質遠端腎小管程度較輕損傷、腎間質炎性細胞浸潤及線粒體破壞，符合藥物性急性腎損傷表現。 電鏡下可看到腎小球有一定程度損傷，但與CI-AKI 是否直接相關尚不能確定。 腎間質無明顯纖維化提示，對比劑導致的腎損傷為急性病理改變。 因此，實驗兔經動脈注入對比劑后造成了比較嚴重的急性腎損傷，其病理變化與sCr、氧化應激反應標記物顯著相關。 目前認為，近端腎小管比遠端腎小管更容易發生缺血和毒性物質損傷的主要原因，在于其產生無氧糖酵解三磷酸腺苷能力較低，缺乏抗氧化劑和抗凋亡蛋白并對線粒體毒性更加敏感［12-14］。 腎小管細胞接觸對比劑后受到外來毒性刺激并發生缺血、缺氧，線粒體發生腫脹、分裂和線粒體吞噬，以減少對腎小管的損害［15］，線粒體功能受損并產生更多活性氧自由基，導致凋亡［16-17］。因此，本研究在電鏡下觀察到近端腎小管明顯的線粒體損傷表現，并可觀察到用于清除損傷線粒體的自噬體增多。

本研究不足之處乃樣本量較小，且應用了較高劑量對比劑，因而達到100%造模成功，這是預實驗中所用劑量12 g/kg 時sCr 升高未達到25%以上的緣故。 進一步實驗中會擴大樣本量，并盡量減少對比劑用量，以更接近臨床實際情況觀察動物模型腎損傷發生。

總之，采用血管介入法經動脈插管注入對比劑可成功構建CI-AKI 兔模型， 其存在明顯的腎功能減退、氧化應激反應和腎損傷病理改變。 氧化應激反應和腎臟病變與碘對比劑所致腎功能損害直接相關。