肉制品中揮發性N-亞硝胺化合物檢測技術研究進展

梁秀清　楊穎　張紅霞　王艷麗　李芳芳　劉艷明

摘 要：揮發性N-亞硝胺化合物在肉制品中痕量存在，其分離、分析十分困難。本文綜述肉制品中揮發性亞硝胺檢測技術研究進展，主要介紹5 種前處理技術包括水蒸氣蒸餾法、固相萃取法、固相微萃取法、微波輔助分散液-液微萃取法和分散固相萃取法，并概述氣相色譜法、液相色譜法對多種揮發性亞硝胺定性定量分析的應用進展。最后指出肉制品中揮發性亞硝胺檢測技術發展中面臨的困難以及未來發展趨勢。

關鍵詞：肉制品;揮發性;N-亞硝胺化合物;檢測技術

Recent Progress in Techniques for Detection of Volatile N-Nitrosamines in Meat Products

LIANG Xiuqing， YANG Ying， ZHANG Hongxia， WANG Yanli， LI Fangfang， LIU Yanming*

（Shandong Institute for Food and Drug Control， Shandong Research Center of Engineering and Technology for

Safety Inspection of Food and Drug， Jinan 250101， China）

Abstract： The separation and analysis of volatile N-nitrosamines in meat products are difficult tasks because they are present at trace levels. In this paper， advances in techniques for the detection of volatile N-nitrosamines in meat products are summarized. Five pretreatment techniques including steam distillation， solid-phase extraction， solid-phase micro-extraction， microwave-assisted extraction coupled with dispersive liquid-liquid micro-extraction and dispersive solid-phase extraction are outlined. The application of gas chromatography and liquid chromatography in qualitative and quantitative analysis of volatile N-nitrosamines is also reviewed. Finally， the difficulties in the development of new techniques for the detection of volatile nitrosamines in meat products and future trends are discussed.

Keywords： meat products; volatile; N-nitrosamines; detection technology

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201123-279

中圖分類號：TS251.6

文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2021）01-0098-07

引文格式：

梁秀清， 楊穎， 張紅霞， 等. 肉制品中揮發性N-亞硝胺化合物檢測技術研究進展[J]. 肉類研究， 2020， 35（1）： 98-104. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201123-279. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

LIANG Xiuqing， YANG Ying， ZHANG Hongxia， et al. Recent progress in techniques for detection of volatile N-nitrosamines in meat products[J]. Meat Research， 2020， 35（1）： 98-104. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201123-279. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

亞硝胺是具有強毒性的化學物質，具有強致畸性和致癌性。亞硝胺的致癌性還存在器官特異性，近年來研究表明某些消化系統腫瘤，如胃癌、食管癌的發病率與膳食中攝入的亞硝胺密切相關[1]。不同的亞硝胺毒性差別很大，其中揮發性亞硝胺尤其是N-亞硝基二甲胺毒性最強。常見的揮發性亞硝胺見表1。

亞硝酸鹽和硝酸鹽是最常見的亞硝化劑，經常作為防腐劑和護色劑用于肉制品中。使用亞硝酸鹽腌制肉可產生令人愉悅的色澤和風味，還能有效抑制肉毒桿菌的生長，延緩氧化酸敗[2-3]。我國GB 2760—2014《食品安全國家標準 食物添加劑使用標準》規定腌臘肉、醬鹵肉、肉灌腸、發酵肉等肉制品中亞硝酸鈉的最大殘留量為30 mg/kg。肉中蛋白質含量豐富，在加工過程中蛋白質容易分解產生肽類、氨基酸和胺類物質，這些物質和亞硝酸鹽、硝酸鹽會在一定條件下反應生成亞硝胺[4]。

由于揮發性亞硝胺的毒性及其對食品安全造成的極大危害，國內外有關肉制品中亞硝胺分析測定的研究主要集中于揮發性亞硝胺化合物。目前，許多國家均制定了對食品中揮發性亞硝胺的限量要求。美國農業部規定腌肉制品中揮發性N-亞硝胺化合物總量的限量為10 ?g/kg[5];加拿大食品檢驗局規定腌肉制品中NDMA、NDEA、NDPA、NDBA、NPIP、NMOR的限量均為10 ?g/kg，NPYR的限量為15 ?g/kg[6];智利規定肉制品中NDMA的限量為30 ?g/kg[6];愛沙尼亞規定NDMA和NDEA總量在肉和肉制品中限量為2 ?g/kg，在煙熏肉制品中為4 ?g/kg[7]，在新鮮魚和煙熏魚中為3 ?g/kg[8];俄羅斯規定N-亞硝胺化合物總量在生食品中限量為2 ?g/kg，在煙熏食品中為4 ?g/kg[9]。我國GB 2762—2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》規定肉類及肉制品和水產品中NDMA限量分別為3.0 ?g/kg和4.0 ?g/kg。

肉制品中揮發性亞硝胺含量極低，且肉制品基質復雜，因此，肉制品中揮發性亞硝胺的分析檢測不僅需要高靈敏度的精密檢測技術，還需要簡捷有效的前處理技術。目前，肉制品中揮發性亞硝胺的前處理技術主要有水蒸氣蒸餾法、固相萃取法、固相微萃取法、微波消解-液-液微萃取法、分散固相萃取法等;儀器檢測方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質譜法、氣相色譜-串聯質譜法、液相色譜法、高效液相色譜-串聯質譜法等。本文對肉制品中揮發性亞硝胺檢測中的前處理方法和儀器方法，包括前處理過程、儀器條件和檢測結果進行綜述，并分析檢測方法的優缺點，以期為亞硝胺相關分析工作提供相應的技術選擇。

1 樣品前處理技術

由于含量低且基質復雜，無論何種檢測方法，樣品的前處理技術均是肉制品中揮發性亞硝胺檢測的難點和關鍵點。目前，樣品的前處理方法主要有水蒸氣蒸餾法、固相萃取法、固相微萃取法、微波消解-液-液微萃取法、分散固相萃取法等。

1.1 水蒸氣蒸餾法

水蒸氣蒸餾法是指將含有揮發性成分的樣品與水共蒸餾，使揮發性成分隨水蒸氣一并餾出，經冷凝分取揮發性成分的浸提方法。揮發性亞硝胺具有親水性和強極性特點，可以被水蒸氣蒸餾法有效提取。該法是食品尤其是肉制品中揮發性亞硝胺檢測的傳統方法，不僅能有效去除大部分的非揮發性雜質，還可實現樣品高倍數濃縮，提高方法的檢出限以滿足檢驗的要求。目前，我國GB 5009.26—2016《食品安全國家標準 食品中N-亞硝胺類化合物的測定》中樣品前處理采用此法。Byun等[2]采用該法提取發酵腸中NDMA和NPYR，考察輻照處理對其含量的影響。李玲等[10]使用水蒸氣蒸餾法測定香腸中9 種揮發性亞硝胺，檢出限為0.02～0.08 ?g/kg、定量限為0.05～0.2 ?g/kg，回收率為62%～78%，回收率偏低，分析其可能的原因是9 種亞硝胺具有強揮發性，在高倍數濃縮過程中容易造成損失。馬興等[12]自主研發快速水蒸氣蒸餾儀，建立快速水蒸氣蒸餾法測定肉制品和水產制品中13 種N-亞硝胺的含量，平均蒸餾時間僅需15 min，大大提高了工作效率。水蒸氣蒸餾法前處理步驟多、操作繁瑣，且由于肉制品中脂肪含量較高，使用該方法會有大量脂肪被同時提取出，在隨后的液-液萃取過程中容易產生乳化現象，為后期的提取凈化造成不便，不適用于高通量分析;有機溶劑用量大，不利于環境和操作人員保護。

1.2 固相萃取法

固相萃取技術是20世紀70年代發展起來的一種替代液-液萃取法的集樣品分離、富集、凈化、溶劑轉換于一體的技術。該技術能有效去除干擾物質，操作簡便，很快引起了學者的關注。Pensabene[13-14]、Fiddler[15]等建立固相萃取技術測定培根中NPYR、NPIP的方法，但該方法主要用于單一基質中單一亞硝胺化合物的分析。1997年，Raoul等[16]采用基質分散固相萃取法，選用商品化硅藻土和Florisil硅土填料，建立兩步固相萃取法測定香腸、煎魚等不同基質中8 種常見揮發性亞硝胺的方法，擴大了固相萃取技術在肉制品中揮發性亞硝胺檢測的分析范圍，但由于柱效較低，以及目標物性質差異較大，該方法對不同亞硝胺的回收率差別較大，其中毒性最大的NDMA回收率僅為40%～58%。隨后，很多學者[17-19]改良了兩步固相萃取法，并將其用于不同肉制品中多種揮發性亞硝胺的分析。隨著固相萃取技術的發展，商品化固相萃取柱柱效高、穩定性好，Sannino等[20]測定肉制品中9 種揮發性亞硝胺的含量時選用商品化ChemElut和Florisil固相萃取柱，所得方法精密度高、重復性好，回收率為95%～110%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為5%～11%。張建斌等[21]考察多種不同固相萃取柱的萃取效果，綜合考慮回收率和對脂肪和色素的去除發現，活性炭效果最佳。而何淑娟等[22]則認為PSA-C18復合固相萃取柱萃取效果更佳。固相萃取法適用于肉制品中揮發性亞硝胺含量的測定，但由于肉制品基質復雜，凈化過程中容易出現堵塞管柱、解吸時間長的問題，提取凈化的難度較大。近年來國內學者[23-24]研究發現，使用氫氧化鋇堿性溶液處理樣品，不僅能除去樣品中大量油脂，有效提取N-亞硝胺，還能促使樣品溶液蛋白沉淀，使其黏度變小，有利于后續固相萃取柱凈化富集。

1.3 固相微萃取法

固相微萃取技術是1990年由Pawliszyn等建立，是將樣品中微量組分的提取、濃縮、解吸、進樣等步驟集于一體的樣品制備技術[25]，在復雜基質中揮發性、半揮發性化合物的分析中應用廣泛。由于其無萃取溶劑、環境友好、檢測快速方便，固相微萃取技術在不同樣品基質中亞硝胺的測定中也得到了較好的應用和發展[26-28]。Sen等[29]將固相微萃取技術應用于肉制品中揮發性亞硝胺的檢測，結果表明，該方法能快速有效測定煙熏火腿中NDBA和N-亞硝基芐基胺，回收率分別為102%～112%、68.9%～84.4%，檢出限分別為3、1 ?g/kg;而對NDMA、NEMA、NPYR、NPIP、NMOR 5 種亞硝胺無法有效提取。因亞硝胺性質差異大，纖維萃取頭涂層孔徑大小各異，因此，不同纖維萃取頭對不同亞硝胺萃取效果不同[30-32]，如DVB/PDMS纖維萃取頭只能有效萃取5 種揮發性亞硝胺，而CAR/PDMS纖維萃取頭則對9 種揮發性亞硝胺均有較滿意的萃取效果。固相微萃取實驗中容易存在萃取不充分、解吸不完全、目標物殘留的問題，造成檢測結果重復性差。Ventanas等[30]研究發現9 種揮發性亞硝胺萃取結果的RSD為14.3%～91.03%。固相微萃取法操作簡單方便，為肉制品中揮發性亞硝胺的檢測提供了新思路，但該方法檢出限高，對肉制品中含量極低的亞硝胺很難準確定性定量檢測。張甜[33]、楊華[34]等考察3 種不同纖維萃取頭對9 種揮發性N-亞硝胺的萃取效果，認為PDMS/DVB/CAR纖維萃取頭萃取效果最佳，并優化了其最佳萃取條件。在固相微萃取中，纖維萃取頭的選擇是影響揮發性亞硝胺提取的重要因素，而纖維萃取頭價格較為昂貴、使用次數有限，因此該方法也不適用于高通量的檢測。

1.4 微波輔助分散液-液微萃取法

微波萃取技術利用微波加熱的方式，快速、高效地將分析物從復雜固體樣品基質釋放到溶液中。Rezaee等[35]報道，分散液-液微萃取是一種基于目標物在樣品溶液和小體積萃取劑之間平衡分配的新型樣品前處理技術。Campillo等[36]將微波萃取技術與分散液-液微萃取法結合，建立肉制品中9 種揮發性亞硝胺的分析方法，并優化微波輔助萃取和分散液-液萃取參數，所得方法靈敏度高，在較少稱樣量下仍然有較低的檢出限，9 種揮發性亞硝胺的檢出限為0.12～0.56 ?g/kg。Amelin[37]和Ramezani[38]等也采用微波輔助分散液-液微萃取法分析香腸、熏制肉制品中7 種揮發性亞硝胺，檢出限分別為0.1～0.5 ?g/kg和0.11～0.48 ?g/kg，與Campillo等[36]的研究結果基本一致。微波輔助分散液-液微萃取法萃取效率和富集倍數較高，但由于萃取劑使用量非常小，是微升級別，在實際檢測中對檢驗人員操作要求較高。

1.5 分散固相萃取法

分散固相萃取法最早是由Anastassiades等[39]于2003年首先提出的一種樣品前處理方法。樣品溶液中加入適當的分散固相萃取吸附劑，利用吸附劑分散在樣品溶液中吸附雜質，達到凈化效果。與分散固相萃取法不同，分散固相微萃取是利用吸附劑吸附目標物，再通過小體積有機溶劑將目標物反萃取。Fu等[40]將分散固相微萃取方法用于測定水樣中5 種揮發性亞硝胺（NDMA、NMEA、NDEA、NDPA、NDBA）;隨后，又將分散固相微萃取法與微波輔助萃取法結合用于肉制品中揮發性亞硝胺的測定，分析5 種不同肉制品中7 種揮發性亞硝胺，回收率為60%～105%[41]。

QuEChERS法是將分散固相萃取與固-液萃取相結合建立的一種快速、簡單、廉價、有效、可靠和安全的樣品前處理技術[42]。Lehotay等[43]將QuEChERS法用于亞硝胺的檢測，建立肉制品中5 種揮發性亞硝胺的QuEChERS分析方法，該方法準確性好、靈敏度高，5 種揮發性亞硝胺加標回收率70%～120%，RSD均小于20%，檢出限0.1 ng/g。國內學者[44-47]也使用QuEChERS法分析肉制品、中式咸魚等不同樣品中9 種揮發性亞硝胺的含量。QuEChERS法操作簡單、提取凈化效果好、成本低廉、靈敏度高、選擇性好，能有效地提高檢測速率和檢測通量。

2 儀器分析技術

隨著分析化學的發展和新儀器的開發應用，食品中亞硝胺的檢測技術也不斷突破，選擇性和靈敏度都在不斷提高，目前常用的亞硝胺分析方法主要包括氣相色譜法、氣相色譜-質譜法、氣相色譜-串聯質譜法、液相色譜法和高效液相色譜-串聯質譜法等。

2.1 氣相色譜法

氣相色譜法是20世紀50年代迅速發展起來的一種分離和分析方法，特別適用于氣體混合物和揮發性化合物的檢測。由于氣相色譜技術具有技術成熟、靈敏度高、分離效能高、選擇性高、可聯合多種檢測器等優點已被廣泛用于食品安全檢測中。氣相色譜法是目前檢測食品中揮發性N-亞硝胺化合物最常用的方法之一。一些學者使用氫火焰離子化檢測器[24，48-49]、氮磷檢測器[33-34，50]分析揮發性亞硝胺，但這2 種檢測器靈敏度差且缺乏特異性，并不適用于肉制品中揮發性亞硝胺的痕量分析。

20世紀70年代，熱能分析儀和氮化學發光檢測器作為亞硝胺特異性檢測器，由于其專用性強、穩定性好、靈敏度高、線性范圍寬，引起了研究者關注。亞硝胺檢測器的檢測機理分為2 步：裂解和化學發光。N-亞硝胺化合物在合適條件下，N-NO鍵裂解生成NO自由基，NO自由基與臭氧反應在室溫下迅速生成激發態NO*，當激發態NO*衰減回到基態時，會發出特征近紅外輻射，發出的光譜強度與N-亞硝胺濃度成正比，通過檢測光譜強度可以線性定量分析N-亞硝胺含量。氣相色譜-熱能分析儀法已被廣泛用于肉制品中揮發性亞硝胺的分析研究[12，51-52]。GB 5009.26—2016中第二法使用氣相色譜-熱能分析儀對肉及肉制品中NDMA進行測定，方法檢出限為0.5 ?g/kg。Grebel等[53]認為氮化學發光檢測器對7 種揮發性亞硝胺的選擇性、靈敏度均優于氮磷檢測器。Ozel[18]、Kocak[19]等采用全二維氣相色譜-氮化學發光檢測器分析肉制品、烤羊肉、蔬菜等不同復雜食品基質中亞硝胺的含量，該方法利用全二維氣相色譜的高效分離能力，降低了對復雜基質前處理過程中凈化要求，同時提高了靈敏度，再結合亞硝胺特異性的氮化學發光檢測器，確保方法定性分析的準確性。但是，由于全二維氣相色譜儀價格昂貴，且2 種亞硝胺檢測器應用范圍窄，適應性不強，僅適用于亞硝胺化合物的檢測，實驗室配備率低。

2.2 氣相色譜-質譜法

氣相色譜-質譜聯用技術結合了氣相色譜的分離能力和質譜確定分子質量和分子結構的能力，對于分析和鑒定復雜多組分有機混合物，是目前公認的最為有效的檢測技術之一，已廣泛用于揮發性亞硝胺的測定。電子轟擊離子化和化學離子化是氣相色譜-質譜聯用技術中常見的離子化方式。電子轟擊離子化技術使用具有一定能量的電子直接作用于樣品分子，使其電離，產生標準化的質譜圖。國內外學者運用氣相色譜-電子轟擊離子源-質譜建立肉制品中揮發性亞硝胺的分析方法[36，54-55]。但因肉制品基質復雜，基質干擾嚴重，對低分子質量亞硝胺尤其是NDMA的定性定量分析仍存在困難，容易出現假陽性。使用化學離子化技術可以避免氣相色譜-電子轟擊離子源-質譜測定時出現的背景干擾嚴重、響應差的問題，使低分子質量亞硝胺有更好的質譜特性和更高的靈敏度。Yurchenko等[8，17]報道用氨氣為反應氣的氣相色譜-電子轟擊離子源-質譜法，分析294 份魚、386 份肉制品中5 種揮發性亞硝胺的含量，5 種揮發性亞硝胺的檢出限為0.09 ?g/kg。文獻[6，41]還報道采用氣相色譜-電子轟擊離子源-質譜方法時，與氨氣相比，以甲醇為反應氣毒性相對較低，對分析人員更安全，檢測成本也更低;此外，該方法產生的離子碎片更少，分析揮發性亞硝胺時不會產生加合離子，靈敏度和特異性好。

2.3 氣相色譜-串聯質譜法

隨著質譜技術的發展，氣相色譜-三重四極桿串聯質譜越來越普及，其抗干擾能力較單極質譜強，可以在低分子質量區域提供高靈敏度和高選擇性的分析，已逐漸成為亞硝胺檢測的常規手段。基質效應是采用質譜分析時普遍遇到的問題，基質效應可增強或減弱目標物的信號，從而影響儀器的靈敏度和重復性，影響檢測結果的準確度。孔祥一等[56]研究表明9 種N-亞硝胺在動物源性食品中表現出較強的基質抑制效應。采用同位素內標法定量，不僅能有效消除基質效應，還能減少前處理過程中帶來的誤差，有效地保證定性、定量結果的準確度。研究[43，57-58]中關于基于電子轟擊電離源的肉制品中低水平多種揮發性亞硝胺低的氣相色譜-串聯質譜檢測方法的報道較多。Sannino等[20]選擇化學離子源、氨氣作反應氣，采用同位素內標法定量以消除基質效應，建立氣相色譜-串聯質譜法檢測肉制品中9 種揮發性亞硝胺的含量。趙莊[59]和朱萌萌[60]等采用空白基質匹配標準曲線定量，不僅檢測效果與采用同位素內標法定量相同，還降低了分析成本。氣相色譜-三重四極桿串聯質譜法能夠滿足肉制品中揮發性亞硝胺的殘留分析。

2.4 液相色譜法

液相色譜法檢測揮發性亞硝胺的報道較少。液相色譜法檢測亞硝胺時需要將亞硝胺衍生化轉變為熒光響應物質，如用丹璜酰氯衍生化。Komarova等[61]采用氫溴酸-乙酸溶液使亞硝胺分解為胺類物質和亞硝根離子，對相應的胺類物質進行丹璜酰氯衍生化，用熒光檢測器測定熏魚、肉制品等食品中NDMA、NDEA的含量，檢測限分別為0.7、2.2 ng/g，回收率分別為（72.0±7.4）%、（74.0±5.8）%。Lu等[62]采用2-（11H-苯（a）咔唑）乙基氯甲酸酯作為衍生化試劑，建立烤腸、醬牛肉等食品中5 種揮發性亞硝胺的高效液相色譜檢測方法，檢測限為0.01～0.07 ng/g，回收率為92.80%～102.10%，RSD為1.9%～3.2%。肖付剛等[63]采用二極管陣列檢測器，蔡魯峰等[64]選擇紫外檢測器，采用高效液相色譜法時均不需衍生化，可直接檢測肉制品中9 種N-亞硝胺。

2.5 高效液相色譜-串聯質譜法

高效液相色譜-串聯質譜法可以直接檢測亞硝胺，具有簡單、靈敏度好和分析速率快等優點。在分析復雜基質樣品時，高效液相色譜-串聯質譜法相對于液相色譜法表現出更好的選擇性、準確度以及更低的定量限。Herrmann等[65-68]建立同時測定肉制品中揮發性、非揮發性亞硝胺的液相色譜-大氣壓化學電離源/電噴霧電離源-串聯質譜方法，兩類亞硝胺的檢出限分別為0.2 μg/kg和1 μg/kg，并分析丹麥肉制品中亞硝胺產生的因素和暴露量。國內學者[69-70]研究表明大氣壓化學電離源模式下NDMA的基質干擾小，靈敏度也較電子噴霧離子源模式下高，能滿足GB 2762—2017中對肉制品和水產品的限量要求。Lehotay等[43]認為液相色譜-串聯質譜法能有效分析培根中的亞硝胺，且方法準確性和重復性好。目前運用此方法分析肉制品中揮發性亞硝胺含量的研究較少，但仍具一定的發展前景。

2.6 其他方法

檢測亞硝胺的方法還有薄層色譜法、紫外-可見分光光度法、電化學法、膠束電動毛細管色譜法等，由于這些方法存在一定的局限性，如靈敏度低、選擇性差、準確度低等，逐漸被大型儀器檢測所代替。

3 結 語

隨著對亞硝胺污染問題的重視以及分析技術和檢測儀器的發展進步，有關肉制品中揮發性亞硝胺的研究取得很大進展，檢測方法和許多肉制品中的污染數據日益完善。但由于樣品基質成分復雜，前處理過程中萃取、凈化難度大，肉制品中痕量分析揮發性N-亞硝胺化合物時，選擇合適的前處理方法和高選擇性、高靈敏度的分離檢測技術仍面臨挑戰。QuEChERS法操作簡單，提取凈化效果好，能有效地提高檢測速率和通量，在肉制品中亞硝胺的分析中具有很好的應用前景。色譜-串聯質譜技術在測定N-亞硝胺化合物方面應用越來越廣泛，檢測靈敏度和準確性也有大幅提升。此外，在線萃取凈化新技術、基于酶聯免疫或膠體金試紙法的快速檢測技術等在食品分析中的應用逐漸增多，而在亞硝胺檢測中應用較少，有待進一步研究。對亞硝胺檢測技術進行深入研究，對實際生產中有效控制肉制品中N-亞硝胺含量，保障肉制品食用安全性和促進肉制品產業發展均具有非常重要的意義。

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收稿日期：2020-11-23

第一作者簡介：梁秀清（1984—）（ORCID： 0000-0001-5665-0393），女，工程師，碩士，研究方向為食品安全檢測。

E-mail： 296822169@qq.com

通信作者簡介：劉艷明（1981—）（ORCID： 0000-0002-2498-5460），女，研究員，博士，研究方向為食品安全檢測。

E-mail： msymliu@163.com