頭針對中風后肢體痙攣大鼠腦皮質中環磷腺苷效應元件結合蛋白影響的研究

胡冠宇，楊 康，王宇峰，叢德毓

（長春中醫藥大學，長春 130117）

中風病嚴重危害人類的生存健康，是一類致死率高、致殘率高的疾病，由于中風后腦功能區血管神經單元損傷，損傷相應腦功能區會導致多種功能障礙的出現。中風后肢體痙攣（post-stroke spasticity，PSS）是中風后主要功能障礙之一。研究表明，全球范圍內中風患者中風后肢體痙攣的發生率為30%～80%[1-4]。中風后肢體痙攣的預后與中風病發病后的及時治療與康復有著密切關聯，頭針療法能改善腦血流及能量代謝，降低興奮性氨基酸毒性，調節神經生長因子，減輕腦組織炎性反應，減緩神經元凋亡[5]。頭針療法在中風后肢體痙攣及中風后偏癱的康復應用較為廣泛，且頭針配合康復訓練較單純的康復訓練效果更優[6]。目前頭針療法在多種神經退行性疾病的治療中得到應用且效果顯著。本文利用大腦中動脈閉阻大鼠動物模型，初步探討環磷腺苷效應元件結合蛋白（CREB）對中風后肢體痙攣大鼠神經細胞恢復的作用機制，及頭針對中風后肢體痙攣大鼠的運動功能改善效應。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 45 只SPF 級8 周齡的雄性Sprague Dawley 大鼠，生產許可證SCXK（吉）-2018-0007，購自長春市億斯實驗動物技術有限公司。大鼠在溫度（23±3）℃、濕度（50±5）%、標準光/暗循環12 h的環境下飼養，自由飲水攝食。

1.2 造模方法及模型評價 適應性喂養1 周后，采用數字隨機法將45 只大鼠隨機分為假手術組15 只和造模組30 只，對造模組大鼠進行線栓法左側大腦中動脈閉阻模型建立，具體方法如下：1）采用腹腔注射3%濃度的戊巴比妥鈉對大鼠進行麻醉，麻醉后對大鼠頸部皮膚備皮、碘伏消毒；2）沿前正中線，在頸部進行切口，并暴露左側頸總動脈（CCA），分離動脈周圍的神經及肌肉；3）找到頸外動脈（ECA），并結扎ECA，同時找到頸內動脈（ICA），在ICA 和CCA 近心端備線，并用動脈夾暫時夾閉CCA 遠心端；4）在動脈夾夾閉近心端附近的做CCA 的微小切口，并將制品線栓（型號：MSRC42B250PK50，瑞沃德/RWD,Shenzhen，China）插入切口，打開動脈夾，并繼續插入線栓約18 mm；5）結扎ICA 和CCA，縫合肌肉及皮膚切口。術后對大鼠腹腔注射4 萬單位的青霉素。假手術組僅僅做1）2）步后進行縫合和青霉素注射。造模后1 d，采用Zealonga 評分和改良Ashworth評分的方法進行模型篩選，評分在1～3 分，改良Ashworth 評分在I 級以上判定為模型成功。

1.3 動物分組及干預方法

1.3.1 動物分組 采用數字隨機法，將造模組大鼠隨機隨機平均分配到模型組和頭針組，頭針組采用頭針干預治療7 d，模型組不做任何干預僅做同期對照觀察；假手術組大鼠不做任何干預僅做同期對照觀察。

1.3.2 頭針干預方法 在造模后對大鼠進行7 d 的頭針干預，每日1 次。具體針刺方法為：采用異氟醚麻醉大鼠，在對應人體的進針區域，對大鼠的頂區和兩側頂前區進行針刺。采用攆轉的方法加強針刺刺激，1 分鐘/只，并用膠帶固定針柄，大鼠清醒后帶針自由活動，2 h 后拔針。

1.4 觀察及檢測方法

1.4.1 行為學檢測 造模后8 d，采用改良Ashworth 評分[7-8]和平衡木行走實驗[9]對大鼠的肌張力及運動能力進行評估。

1.4.2 組織學檢測 造模后8 d，對大鼠腦組織進行取材，采用4%多聚甲醛固定組織，并進行石蠟包埋切片。并對大腦皮質尼氏染色，觀察視野內神經細胞核及尼氏小體的變化。

1.4.3 Westernblot 造模后8 d，對大鼠患側腦皮質組織總蛋白進行BCA 蛋白定量，并進行蛋白變性，經SDS-PAGE 電泳凝膠電泳、轉膜、封閉。一抗孵育，4 ℃冰箱過夜。二抗室溫孵育 1 h 后，對含有蛋白條帶的 PⅤDF 膜進行 ECL 化學發光，并對發光結果進行統計分析。

1.4.4 RT-PCR 造模后8 天，取材患側腦皮質組織，按Trizol 試劑盒提供的方法提取RNA，采用實時熒光定量PCR法對腦皮質中CREB mRNA表達水平進行測定，GAPDH 作為內參對照，引物序列見表1。

表1 CREB、GAPDH 引物信息

1.5 統計學方法 采用 SPSS 22.0 統計分析數據，用均數 ± 標準差（）表示計量資料，多組間比較采用單因素方差分析，不符合正態分布的數據，采用非參數檢驗秩和檢驗。

2 結果

2.1 頭針對肢體痙攣的治療效應 頭針干預對肢體痙攣的治療效應采用改良Ashworth 評分和平衡木行走實驗進行評價。見表2。結果說明，頭針干預能有效改善中風后出現的肢體痙攣狀態。

表2 各組大鼠頭針干預8 d 行為學指標比較（，n =6）

表2 各組大鼠頭針干預8 d 行為學指標比較（，n =6）

注：與假手術組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△ P ＜0.05

2.2 頭針對大鼠皮質尼氏體結構及數量的影響 各組尼氏染色結果如圖1 所示（圖1A 為假手術組，圖1B為模型組，圖1C 為頭針組）。假手術組大鼠大腦皮質神經元排列整齊致密，形態規則，且神經元內尼氏體充盈，呈虎斑狀或點狀；模型組大鼠皮質神經元排列散亂、間隙較大，尼氏體數量較少，染色較淺；頭針組大鼠海馬區神經元形態有所改善，排列較為整齊，尼氏體數量增多，染色加深。

2.3 頭針干預對腦皮質中CREB 的影響 如圖2 所示，頭針后第8 天，與假手術組相比，模型組大鼠皮質中CREB 蛋白表達顯著降低，差異具有統計學意義，模型組大鼠皮質中p-CREB 蛋白表達較之無顯著性差異；頭針組大鼠皮質中CREB 及p-CREB 蛋白表達明顯增加，與模型組相比，差異具有統計學意義。CREB、p-CREB 相對表達量比較及統計分析結果詳見表3。

圖1 各組大鼠腦皮質組織神經細胞變化（尼氏染色，×400）

圖2 各組大鼠腦皮質 CREB、p-CREB 蛋白表達結果

應用PCR 檢測各組大鼠CREB 對應mRNA 的表達。如表4 所示，與假手術組相比，模型組大鼠皮質中CREB mRNA 表達顯著降低（P＜0.05）；而頭針組大鼠皮質中CREB 蛋白表達明顯增加，與模型組相比，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表3 各組大鼠皮質中CREB、p-CREB 蛋白相對表達量比較（，n =3）

表3 各組大鼠皮質中CREB、p-CREB 蛋白相對表達量比較（，n =3）

注：與假手術組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△ P ＜0.05

表4 各組大鼠CREB mRNA 相對表達比較（，n =6）

表4 各組大鼠CREB mRNA 相對表達比較（，n =6）

注：與假手術組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△ P ＜0.05

3 討論

中風后肢體痙攣在中醫學范疇內歸類于“痙病”[10]。中醫學研究認為，肢體痙攣的發病主要責之于患者氣血瘀滯不通而產生的筋脈失養。采取頭針對頭部穴位刺激的方式，可調周身的經氣運行，根據中醫氣行則血行的理論，進一步促進了肢體氣血津液運行的恢復。中風后肢體痙攣的發生，通常都是其上運動神經元受損，導致患者中樞神經系統出現應激反射神經反應，進而致使患者出現不受意識控制的高肌張力反應。CREB 是真核生物細胞核內的調控因子，是腦源神經營養因子BDNF 的上游信號，能夠影響BDNF 的轉錄與合成，其相關的信號通路是促進中風后腦組織恢復的重要途徑[11-13]。大腦中動脈閉阻是目前公認的腦卒中動物模型之一[14-15]，能較為精確的還原缺血性腦卒中或大腦的缺血再灌注損傷的病理過程，且模型的可重復性強、損傷程度可控，創口在頸部前正中線且范圍較小，適用于頭針的動物實驗研究。據研究顯示，頭針在改善中風后運動功能障礙方面主要具有調節神經遞質[16]、促進腦功能重塑[17]、改善神經電生理[18]、改善腦部側支循環[19]及促進神經修復[20]等多方面的效應。本研究通過動物行為學實驗發現，頭針能夠明顯改善中風后肢體痙攣大鼠的肢體痙攣程度和運動能力。結合組織學和蛋白檢測的結果，本研究發現，頭針能夠明顯增加大鼠皮質內CREB、p-CREB 蛋白及mRNA 的表達，并發揮了促進神經細胞恢復的作用，這可能與CREB 相關通路的激活有關。

綜上所述，頭針可有效調節CREB 的表達，并對腦皮質中神經細胞的恢復具有促進作用，從而起到了對中風后肢體痙攣的治療效應。