基于公共數(shù)據(jù)庫分析MFAP2在食管癌中表達及其預(yù)后意義

孫文 舒揚

1常州市第四人民醫(yī)院檢驗科，江蘇213000；2江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室，鎮(zhèn)江212000

食管癌是世界上第八大癌癥，同時病死率在癌癥相關(guān)死亡中排名第六［1］。食管癌有80%的病例發(fā)生在欠發(fā)達的發(fā)展中國家，其中亞洲和非洲發(fā)病率最高［2］。食管癌通常被診斷出來就已是晚期階段，主要原因是癌癥早期缺乏典型的臨床癥狀以及與其他相關(guān)疾病癥狀相似而被漏診。患有晚期疾病患者最常見的癥狀是會出現(xiàn)進行性吞咽困難或無意識的體質(zhì)量減輕［3］。全球食管癌患者5年總體生存率為15%～20%［4］，所以提高疾病的早期診斷率有助于降低病死率。本文的研究目的就是要尋找到一個新的食管癌預(yù)后生物標(biāo)志物。

微纖維相關(guān)糖蛋白2（MFAP2）存在于許多組織的細胞外基質(zhì)中，是彈性蛋白相關(guān)微纖維的主要抗原，可與原纖維蛋白相互作用以調(diào)節(jié)微纖維的功能，也是遺傳性結(jié)締組織病的病因。目前的科學(xué)研究表明，MFAP2在很多腫瘤中的表達增高，例如胃癌［5］、黑色素瘤［6］、頭頸部鱗狀細胞癌，但MFAP2在食管癌中表達及預(yù)后文獻報道少見。本研究首先檢索Oncomine及GEPIA數(shù)據(jù)庫中有關(guān)MFAP2在食管癌中的表達信息，然后利用在線網(wǎng)站UALCAN從多個角度分析MFAP2在不同臨床信息的食管癌患者組織樣本中的mRNA表達，并通過Kaplan-Meier Plotter在線分析MFAP2在食管癌中的表達與臨床預(yù)后的相關(guān)性；最后通過STRING構(gòu)建目的基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，以期了解MFAP2在食管癌中的功能作用，為尋找新的食管癌早期診斷指標(biāo)、預(yù)后標(biāo)記物及潛在的治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 MFAP2在Oncomine數(shù)據(jù)庫中的表達Oncomine數(shù)據(jù)庫（https：//www.oncomine.org/）是一個全世界知名的腫瘤基因數(shù)據(jù)庫，可以直接生成可視化圖片結(jié)果，其高效能的分析能力和大量儲存樣本保證分析結(jié)果具有較大的參考價值。首先登錄Oncomine數(shù)據(jù)庫，然后進行檢索條件的設(shè)置：（1）Input：Esophageal cancer；（2）Gene：MFAP2；（3）Select the analysis type：cancer vs.normal。通過上述搜索可以獲得有關(guān)MFAP2的數(shù)據(jù)集，然后進行具體分析。

1.2 MFAP2在GEPIA數(shù)據(jù)庫中的表達GEPIA數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html）是基于癌癥和正常基因表達譜分析的一個公共數(shù)據(jù)庫。其數(shù)據(jù)來源于TCGA以及GTEx項目的腫瘤和正常樣本的RNA測序數(shù)據(jù)，可以進行非常全面地表達分析。首先打開GEPIA在線軟件，在differential genes下的Dateset選擇ESCA，其余默認(rèn)|log2FC|Cutoff：1，q-value cutoff：0.01，選用ANOVA方法，最后點擊List，即可得出ESCA的差異表達基因。

1.3 MFAP2基因在人食管癌和正常組織中的表達分析UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）是一個可以公開訪問的癌癥數(shù)據(jù)在線分析網(wǎng)站，可以用來驗證新的生物標(biāo)志物，提供基因表達水平、生存分析、相關(guān)性分析。利用UALCAN在線分析軟件分析MFAP2基因在食管癌及正常癌組織中的表達。在軟件主頁輸入MFAP2基因，選擇食管癌組織，獲得MFAP2在正常組織和食管癌組織中的差異表達，本研究將從原發(fā)食管癌原發(fā)組織、不同種族、不同性別、不同年齡階段、不同分期、不同分級、不同的抽煙狀態(tài)、TP53是否突變與正常鄰近組織的表達情況等多個角度分析MFAP2的表達差異。

1.4 生 存 分 析Kaplan-Meier Plotter（http：//www.kmplot.com/）是一個新的生物預(yù)后指標(biāo)分析工具，數(shù)據(jù)來源于GEO、EGA和TCGA數(shù)據(jù)庫，為了分析特定基因在腫瘤的預(yù)后價值，根據(jù)擬議生物標(biāo)志物的各種分位數(shù)表達，將患者樣品分為兩組。通過Kaplan-Meier生存圖比較這兩個患者隊列，并計算95%置信區(qū)間和logrankP值的危險比。首先登錄Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫，輸入MFAP2基因，分別選擇在食管腺癌和食管鱗癌中進行總生存分析。

1.5 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)STRING（http：//string-db.org/）是一個搜尋已知和預(yù)測蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù)庫，可以用于分析基因組學(xué)的數(shù)據(jù)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的注釋，探索預(yù)測目的基因蛋白的相互作用。數(shù)據(jù)來源于收集和重新評估有關(guān)于目前現(xiàn)有的實驗數(shù)據(jù)，已知數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)復(fù)合物［7］，然后再Search框中輸入MFAP2基因，物種選擇“Homo sapiens”進行搜索，在“settings”中選擇minimum required interaction score為0.04，最后在“Exports”中下載。

2 結(jié) 果

2.1 MFAP2在各種腫瘤中的表達在Oncomine數(shù)據(jù)庫中收集到了430項有關(guān)MFAP2基因表達在正常組與腫瘤組的研究數(shù)據(jù)集，其中MFAP2表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義的數(shù)據(jù)集一共有107項，有104項MFAP2表達增高，3項表達降低。而在食管癌的研究中只有4項表達增高，未有表達降低的研究數(shù)據(jù)集（圖1）。

2.2 MFAP2在食管癌中的表達在Oncomine數(shù)據(jù)庫中共找到4項MFAP2在食管癌中表達增高的數(shù)據(jù)集。這些數(shù)據(jù)集發(fā)表的雜志分別是Clinical Cancer Research、BMC Genomics、Cancer Research和PLoS One。筆者通過對找到的4項有關(guān)MFAP2在食管癌中表達增高的數(shù)據(jù)集中進一步分析，發(fā)現(xiàn)與正常組相比，MFAP2在食管癌中顯著高表達（P＜0.05）（表1）。為了驗證以上分析結(jié)果，筆者進一步挖掘分析GEPIA數(shù)據(jù)庫，在differential genes中找到食管癌數(shù)據(jù)集中的差異基因，其中包含了MFAP2基因（log2FC=2.897，校正P=8.86E-57），發(fā)現(xiàn)MFAP2基因在食管癌中的表達上調(diào)。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中MFAP2基因在腫瘤中的整體表達情況

2.3 MFAP2基因在不同臨床信息的食管癌組織及正常組織中的表達利用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析MFAP2基因在不同臨床信息的食管癌組織與正常組織中的表達差異。通過上述UALCAN數(shù)據(jù)庫的分析，筆者發(fā)現(xiàn)和正常組織相比，MFAP2基因在21～60歲人群、1級食管癌患者、吸煙的食管癌患者中顯著上調(diào)（圖2）。

2.4 MFAP2在食管癌中的生存預(yù)后分析為了探索MFAP2與食管癌之間的生存預(yù)后關(guān)系，利用Kaplan-Meier Plotter在線網(wǎng)站，分別獲得MFAP2在食管腺癌及食管癌的臨床樣本，并進行總生存分析。根據(jù)目的基因的表達差異將其分為高表達組與低表達組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MFAP2基因在高表達組的食管腺癌患者生存率較低（P=0.035），而MFAP2的表達水平與食管鱗狀細胞癌患者生存預(yù)后之間不存在相關(guān)（P=0.066）（圖3）。

通過在線數(shù)據(jù)庫Kaplan-Meier Plotter進一步探索MFAP2在不同食管腺癌中的生存預(yù)后關(guān)系，對不同臨床樣本信息的食管腺癌患者進行生存預(yù)后分析：在男性，調(diào)節(jié)性T細胞富集、富含2型輔助性T細胞的食管腺癌患者中生存率較低，預(yù)后相對較差。而在巨噬細胞富集的食管癌患者中生存率較高，預(yù)后較好（圖4）。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建MFAP2基因的PPI網(wǎng)絡(luò)用于探索MFAP2基因的功能，共發(fā)現(xiàn)10個與之相關(guān)的功能蛋白（圖5）。其中纖維蛋白1（FBLN1）引起了注意，F(xiàn)BLN1是一種分泌的糖蛋白，已整合到纖維狀細胞外基質(zhì)中，需要鈣結(jié)合來介導(dǎo)其與層粘連蛋白和硝態(tài)素的結(jié)合。FBLN1通過結(jié)合纖維蛋白原介導(dǎo)血小板粘附。FBLN1在結(jié)腸癌［12］、肝癌［13］中已有相關(guān)報道。這個蛋白基因也被證實與食管腺癌的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后有關(guān)［14］。為了進一步確定它們之間的關(guān)系，筆者通過在線軟件GEPIA進行Spearman相關(guān)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MFAP2與FBLN1的表達為正相關(guān)（圖6）。

3 討 論

食管癌是一個極具侵略性和較差存活率的異質(zhì)性疾病，由于其遺傳學(xué)病史及較低的早期診斷率，是全世界面臨的健康問題之一，也是中國最常見的惡性腫瘤之一［15］，在我國各種惡性腫瘤中病死率占居第4位。在中國有一個明顯的特征，就是城市與農(nóng)村的食管癌患者分布不一致，農(nóng)村地區(qū)的食管癌患者的發(fā)病率遠高于城市地區(qū)的患者［16］。食管癌發(fā)生的主要危險因素有吸煙、飲酒、肥胖、胃食管反流、飲食習(xí)慣等。其中食管腺癌發(fā)生的主要危險因素是肥胖、胃食管反流，反流癥狀越頻繁、越嚴(yán)重、持續(xù)時間越長，風(fēng)險就越大。吸煙和飲酒是食管鱗狀細胞癌患者的兩大危險因素，常見于發(fā)達國家［17］。越來越多的研究證據(jù)表明，對食管癌分子組成的全面理解不僅需要關(guān)注腫瘤細胞，而且還需要關(guān)注腫瘤微環(huán)境，其中包含多種細胞群、信號傳導(dǎo)因子以及與腫瘤細胞相互作用并支持腫瘤各個階段的結(jié)構(gòu)分子［18］，了解食管癌的發(fā)生發(fā)展對于其診斷和治療非常重要。筆者運用生物信息學(xué)的方法對以上數(shù)據(jù)庫進行分析挖掘，發(fā)現(xiàn)MFAP2在食管癌中表達上調(diào)以及MFAP2高表達的食管腺癌患者的生存率低。

近年來，有關(guān)MFAP2基因在腫瘤中過表達的報道越來越多，而未見其在食管癌中的研究報道。本研究利用公共數(shù)據(jù)庫Oncomine在線分析發(fā)現(xiàn)MFAP2基因在食管癌中的表達增高。通過GEPIA數(shù)據(jù)庫在線對目的基因MFAP2進行差異分析，進一步驗證了這一結(jié)論。為了進一步了解MFAP2在不同臨床病理信息的食管癌患者中的表達情況，筆者利用UALCAN數(shù)據(jù)庫在線分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)和正常的食管組織相比，MFAP2在21～60歲的人群，分級為1級的患者中，抽煙的食管癌患者中MFAP2基因上調(diào)更顯著。利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫進行在線分析，把MFAP2基因按表達水平分為兩組，分別為表達上調(diào)組和表達下調(diào)組，在表達上調(diào)組的食管腺癌患者總體生存率較差；然而MFAP2的表達水平與食管鱗狀細胞癌患者生存預(yù)后之間不存在相關(guān)。筆者通過在線數(shù)據(jù)庫Kaplan-Meier Plotter又進一步探索MFAP2在不同臨床信息及不同免疫細胞浸潤的食管腺癌患者中的預(yù)后分析，結(jié)果顯示：在男性、調(diào)節(jié)性T細胞富集、富含2型輔助性T細胞的食管腺癌患者中生存率較低，預(yù)后相對較差。而在巨噬細胞富集的食管癌患者中生存率較高，預(yù)后較好。通過STRING數(shù)據(jù)庫在線構(gòu)建MFAP2基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，為研究目的基因的功能提供線索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有10個預(yù)測的功能蛋白與MFAP2相互作用，其中FBLN1蛋白基因被證實與食管腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，食管腺癌中FBLN1發(fā)生了復(fù)雜的染色體重排并產(chǎn)生了新型融合轉(zhuǎn)錄本。利用GEPIA數(shù)據(jù)庫對MFAP2與FBLN1基因進行Spearman相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)MFAP2與FBLN1的表達為正相關(guān)的關(guān)系，說明MFAP2基因可能影響食管腺癌患者的預(yù)后，也有可能會引起染色體的重排。通過對MFAP2基因在食管癌中表達及預(yù)后進行全面分析，發(fā)現(xiàn)MFAP2具有重要的研究意義，MFAP2基因作為一種細胞外基質(zhì)蛋白［19］，可能與調(diào)節(jié)性T細胞、2型輔助性T細胞等免疫細胞共同影響著食管腺癌的腫瘤微環(huán)境［18］，同時也可能成為食管腺癌的一個新的生物學(xué)指標(biāo)以及潛在的治療靶點。

表1 MFAP2在食管癌研究中的過度表達情況

圖2 MFAP2在不同臨床信息的食管癌組織中的差異表達（A為正常食管組織比原發(fā)食管癌，B為正常食管組織比不同年齡段的食管癌，C為正常食管組織比不同分級的食管癌，D為正常食管組織比不同抽煙狀態(tài)的食管癌）

圖3 MFAP2在食管腺癌與食管鱗狀細胞癌中的預(yù)后生存曲線（A為MFAP2在食管腺癌中的預(yù)后生存曲線，B為MFAP2在食管鱗狀細胞癌中的預(yù)后生存曲線）

圖4 MFAP2在不同食管腺癌中的生存預(yù)后關(guān)系（A為男性食管腺癌患者的MFAP2表達，B為巨噬細胞富集患者的MFAP2表達，C為調(diào)節(jié)性T細胞富集患者的MFAP2表達，D為富含2型輔助性T細胞患者的MFAP2表達）

圖5 構(gòu)建MFAP2基因相關(guān)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖6 MFAP2基因與FBLN1的表達呈正相關(guān)

總之，本研究通過綜合公共數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)信息進行深入挖掘，提出MFAP2可能是食管癌中的潛在的促癌基因，且生存分析發(fā)現(xiàn)MFAP2與食管腺癌患者預(yù)后有關(guān)，與食管鱗狀細胞癌患者的預(yù)后不相關(guān)，同時MFAP2可能與免疫細胞共同影響著食管腺癌的腫瘤微環(huán)境。構(gòu)建MFAP2蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果提示MFAP2極有可能與染色體的異常有關(guān)。生物信息學(xué)的快速發(fā)展加快了科學(xué)研究者們研究的步伐［20］，但由于其缺乏實驗數(shù)據(jù)的佐證，不能更深入驗證MFAP2在食管腺癌中作用機制。所以MFAP2在食管腺癌中的發(fā)生發(fā)展機制及其具體功能還有待進一步研究。