糖尿病足患者皮膚微循環(huán)結構及HIF-1α、VEGF表達水平的改變1

林楚佳，藍尤冕，歐妙瓊，鄞國書，楊曉平，林少達

（汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，廣東 汕頭 515041）

糖尿病足病皮膚與正常皮膚相比具有典型組織學改變，真皮乳頭層內(nèi)血管數(shù)量明顯減少，影響創(chuàng)面的血供[1]。缺氧誘導因子-1α（Hypoxia Inducible Factor-1α,HIF-1α）作為調(diào)控血管新生的一種核轉錄因子，可通過調(diào)控下游基因血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF ）促進微血管形成，促進側支循環(huán)建立。我們前期的研究工作發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠創(chuàng)面HIF-1α及VEGF總體表達水平降低，導致創(chuàng)面愈合過程血管形成不足[2]，因此推測HIF-1α及VEGF在人類糖尿病皮膚表達下降可能是糖尿病創(chuàng)面愈合延遲的原因之一。我們觀察30例糖尿病足潰瘍患者皮膚微循環(huán)結構改變及真皮層HIF-1α、VEGF水平的改變，探討HIF-1α、VEGF水平改變在糖尿病足潰瘍難愈合以及修復過程中的作用機制。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 按符合1999年世界衛(wèi)生組織WHO糖尿病診斷標準并且足部出現(xiàn)潰瘍和/或深層組織破壞的入選標準，選擇2017年7月至2018年10月在汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的30例糖尿病足病患者作為研究對象，其中男性16例，女性14例，平均年齡（62.36±10.82）歲，糖尿病病程96個月。本研究獲得醫(yī)院倫理學委員會批準，患者均自愿參加并簽署知情同意書。同時入選因下肢外傷行外科手術治療的住院非糖尿病患者20例作為對照組，其中男性11例，女性9例，平均年齡（59.43±9.82）歲，從切除的多余皮膚中進行取材。兩組患者性別、年齡差別無統(tǒng)計學意義。

1.2 方法

1.2.1 皮膚組織標本的采集 糖尿病足組患者常規(guī)消毒后取傷口皮膚，使用無菌手術剪對糖尿病足病皮膚潰瘍邊緣皮膚組織進行皮膚全層取材，大約0.5cm×1cm，去除皮下脂肪組織，一份立即放入4%多聚甲醛中固定，于48h內(nèi)制成蠟塊保存，用于免疫組化；另一份立即放入液氮中，并盡快放入-80℃冰箱保存，用于ELISA及熒光定量PCR。非糖尿病足對照組患者在外科手術過程中按手術需求切除多余皮膚并進行皮膚取材。

1.2.2 免疫組化觀察皮膚微循環(huán)結構特點及檢測皮膚HIF-1a、VEGF的表達 HE染色對比兩組觀察對象皮膚真皮層組織結構。通過免疫組化方法，用血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子（CD31）標記皮膚組織中的血管。200倍鏡下每張切片隨機選取4個視野進行真皮乳頭內(nèi)微血管計數(shù)、測量真皮乳頭區(qū)域面積，計算微血管密度（微血管密度=微血管數(shù)÷乳頭層面積）。通過免疫組化方法對各組皮膚石蠟切片進行HIF-1a、VEGF抗體染色，應用Image pro plus 6.0軟件對圖像進行各指標的量化分析，400倍鏡下每張切片隨機選取4個視野觀察皮膚表皮HIF-1a、真皮乳頭內(nèi)VEGF表達強度的平均光密度值。

1.2.3 ELISA檢測皮膚組織勻漿HIF-1α、VEGF水平 用ELISA雙抗夾心法，以特異性HIF-1α、VEGF單克隆抗體包被，酶聯(lián)特異性HIF-1α、VEGF多克隆抗體作為二抗檢測。操作嚴格按照試劑盒（英國R＆D Systems公司）說明書執(zhí)行。

1.2.4 熒 光 定 量PCR檢 測 皮 膚HIF-1α mRNA、VEGF mRNA水平 熒光定量PCR試劑和儀器：Tripure試劑、逆轉錄試劑盒及SYB Green qRT-PCR Master Mix（Roche公 司，美 國）、DEPC（Sigma公司，美國）、低溫高速離心機及紫外分光光度儀（Eppendorf公司，德國）、CFX Connect熒光定量PCR檢測系統(tǒng)（Bio-Rad公司，德國）。引物基因序列采用NCBI自行設計，同時經(jīng)NCBIBLAST檢索無顯著同源性。取2-△△Ct代表目的基因的相對表達量。

1.2.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料進行正態(tài)性檢驗，方差齊性檢驗。正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 皮膚真皮層HE染色觀察及免疫組化觀察糖尿病足皮膚微循環(huán)結構特點 皮膚HE染色見糖尿病足組皮膚基底膜變薄扁平，真皮乳頭面積增大，真皮膠原纖細、變性、斷裂，纖維束排列紊亂。CD31免疫組化觀察糖尿病足病組皮膚真皮乳頭密度（59.2±16.7）個/mm2比非糖尿病組（77.6±11.2）個/mm2下降（P=0.032）。糖尿病足病組皮膚真皮乳頭微血管密度（110.7±28.4）條/mm2比非糖尿病組（156.2±27.5）條/mm2下降（P=0.017）。見圖1。

圖1 非糖尿病組及糖尿病足病組皮膚真皮乳頭微血管密度（IHC×200）

2.2 皮膚HIF-1α、真皮層乳頭VEGF的表達強度HIF-1α蛋白陽性表達為細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。HIF-1α在非糖尿病皮膚表皮基底層細胞核呈陽性表達，而在糖尿病足病足皮膚表皮基底層表達明顯減弱。非糖尿病組皮膚表皮HIF-1α表達平均光密度值（0.28±0.07）明顯高于糖尿病足組（0.13±0.04），P=0.022。見圖2。非糖尿病組皮膚及糖尿病足組皮膚真皮層HIF-1α蛋白均呈陰性表達。

圖2 非糖尿病組及糖尿病足病組皮膚HIF-1α表達（IHC×400）

VEGF主要表達與細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)金黃色顆粒，非糖尿病組皮膚表皮層真皮層細胞均有陽性表達，糖尿病足組皮膚表皮層真皮層VEGF表達減弱。非糖尿病組皮膚真皮乳頭內(nèi)VEGF表達平均光密度值（0.51±0.07）明顯高于糖尿病足組真皮乳頭內(nèi)VEGF表達光密度值（0.39±0.04），P=0.029。見圖3。

2.3 ELISA檢測皮膚真皮層組織勻漿HIF-1α、VEGF水平，熒光定量PCR檢測皮膚HIF-1α mRNA、VEGF mRNA水平，見表1。

3 討論

缺血缺氧誘導后新生血管生成障礙是糖尿病皮膚軟組織再生修復障礙的主要原因之一[3]。皮膚真皮乳頭層是真皮層與表皮層的物質(zhì)交換場所，微血管結構及真皮乳頭生長狀態(tài)對傷口的愈合有重要影響。本次實驗結果顯示，糖尿病足皮膚組織學結構發(fā)生改變，糖尿病足病組創(chuàng)口周圍皮膚真皮乳頭密度下降，真皮乳頭微血管密度比非糖尿病組下降，表明糖尿病足創(chuàng)面愈合過程血管形成不足。糖尿病足皮膚真皮乳頭層微循環(huán)結構的改變與糖尿病足的發(fā)生發(fā)展有著密切關系，血管新生障礙和/或延遲導致的缺氧缺血是糖尿病創(chuàng)面難以愈合的重要原因之一[4]。HIF-1α作為一種核轉錄因子，其調(diào)控的多種靶基因參與機體能量代謝、血管生成、細胞增殖和遷移、細胞凋亡等病理生理過程，在創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮了重要作用[5]。在正常氧濃度條件下，HIF-1α被脯氨酸羥化酶羥化后降解；在缺氧條件下，HIF-1α不被降解而在細胞內(nèi)蓄

表1 皮膚組織勻漿HIF-1a、VEGF濃度及HIF-1α、VEGFmRNA表達水平 單位：ng/ml

積，通過核定位信號介導入細胞核激活下游基因表達，對機體內(nèi)的一系列因素進行調(diào)節(jié)[6]。HIF-1α可通過調(diào)控下游基因包括VEGF等改善微血管病變。有研究表明，皮膚創(chuàng)傷后HIF-1α表達升高，進而上調(diào)一系列成血管因子如VEGF的表達水平，觸發(fā)機體血管新生，促進側支循環(huán)建立[7]。本實驗結果顯示非糖尿病皮膚表皮HIF-1a表達明顯高于糖尿病足皮膚表皮HIF-1α表達；非糖尿病皮膚真皮乳頭內(nèi)VEGF表達明顯高于糖尿病足真皮乳頭內(nèi)VEGF表達。ELISA檢測皮膚真皮層組織勻漿HIF-1α、VEGF水平，熒光定量PCR檢測皮膚HIF-1α、VEGFmRNA水平均提示糖尿病皮膚組織HIF-1α和VEGF在表達水平及其相關mRNA表達量較非糖尿病組下降。原因可能是高糖水平促進超氧化物的增加，誘發(fā)細胞內(nèi)丙酮醛積累，從而減少HIF-1α的轉錄活動[8]。糖尿病足創(chuàng)口難愈合的主要因素可能是皮膚組織HIF-1α和VEGF表達的減少、微血管密度下降、血液供應不足。

總之，HIF-1α及VEGF在糖尿病創(chuàng)口愈合中起到重要作用，其表達水平的下降導致新生血管的缺乏，并且延遲愈合過程。本次研究在治療糖尿病創(chuàng)口愈合中起到指導性意義，提示糖尿病足治療過程要關注皮膚微循環(huán)的改善。在未來，我們將會進一步探索紅外治療技術是否能提高糖尿病足患者皮膚HIF-1α及VEGF的表達，促進糖尿病創(chuàng)口的愈合。