利用基質(zhì)膠阻斷門靜脈建立改良ALPPS手術(shù)小鼠模型

沈 皓，陳 瑤，沈 鋒，吳孟超

（海軍軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院國(guó)家肝癌科學(xué)中心，上海 200438）

聯(lián)合肝臟分隔和門靜脈結(jié)扎的二步肝切除（associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy，ALPPS）是近年來(lái)出現(xiàn)的一種肝切除手術(shù)的新策略，主要適用于腫瘤切除術(shù)后剩余肝臟體積不足的患者，被認(rèn)為是“肝臟腫瘤外科極具前景的發(fā)現(xiàn)之一”[1-2]。ALPPS可刺激術(shù)后剩余肝臟快速再生，然而其機(jī)制尚不明確。現(xiàn)有的ALPPS動(dòng)物模型多來(lái)自豬、羊和大鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[3-5]。目前僅瑞士蘇黎世大學(xué)和日本帝京大學(xué)報(bào)道了基于顯微外科技術(shù)建立的小鼠ALPPS模型[6-7]。由于小鼠具有繁育周期短、飼養(yǎng)成本低且易于進(jìn)行基因編輯等優(yōu)勢(shì)，所以建立一種不依賴顯微外科技術(shù)的簡(jiǎn)易ALPPS模型對(duì)于肝臟再生機(jī)制研究很有必要。本研究以C57BL/6小鼠為對(duì)象，利用基質(zhì)膠（matrigel）注射封堵門靜脈技術(shù)，成功建立了一種改良的ALPPS手術(shù)模型，并驗(yàn)證了其刺激肝再生的有效性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)

SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠75只，8～10周齡，體質(zhì)量為19～21 g，購(gòu)自上海南方模式生物科技有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2017-0012，質(zhì)量合格證號(hào)為20190008530971]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)及手術(shù)操作在國(guó)家肝癌科學(xué)中心屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行[SYXK（滬）2020-0010]；所有小鼠均用普通飼料喂養(yǎng)，可自由獲取食物和水。本研究通過(guò)東方肝膽外科醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（EHBHACUC 2020-0031），符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)范。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及ALPPS模型建立

75只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：ALPPS-顯微手術(shù)組（ALPPS-micro）、ALPPS-基質(zhì)膠封堵組（ALPPS-matri）和基質(zhì)膠封堵對(duì)照組（Control-matri）。每組25只。

ALPPS-micro組手術(shù)操作主要參照Schlegel等[6]報(bào)告的方法。簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)，ALPPS一期手術(shù)包括以下步驟：（1）離斷鐮狀韌帶，上翻中肝葉，游離并切除膽囊；（2）顯微鏡下游離左中葉、左葉、右葉和尾狀葉的門靜脈分支并結(jié)扎，注意保護(hù)以上肝葉的膽管及肝動(dòng)脈，并保留肝臟右中葉的所有脈管（圖1A）；（3）沿中肝葉缺血線處，離斷肝臟（圖1B）。一期術(shù)后2d進(jìn)行二期手術(shù)。二期手術(shù)包括以下步驟：（1）分離黏連，注意控制出血；（2）切除萎縮的左中葉、左葉、右葉和尾狀葉，保留增大的右中葉（圖1C）。

ALPPS-matri組的一期手術(shù)包括以下步驟：（1）第一步同ALPPS-micro組。（2）第二步有改良：肉眼直視下找出左中葉門靜脈分支，胰島素針抽取預(yù)冷至4 ℃的基質(zhì)膠50 μL，沿門靜脈分支入肝方向30°進(jìn)針（圖1D），進(jìn)針時(shí)注意避開(kāi)膽管和肝動(dòng)脈；針頭進(jìn)入血管即停止進(jìn)針，注意不要穿破對(duì)側(cè)血管壁；迅速注入50 μL基質(zhì)膠；觀察到進(jìn)針處血管泛白，對(duì)應(yīng)肝葉顏色變暗后緩慢出針，棉簽適當(dāng)壓迫止血。按以上步驟依次阻斷左葉、右葉和尾狀葉的門靜脈分支。（3）第三步同ALPPS-micro組。二期手術(shù)操作均同ALPPS-micro組。

圖1 ALPPS手術(shù)示意圖Figure 1 Diagram of ALPPS operation

Control-matri組處理方法如下。一期手術(shù)包括以下步驟：（1）和（2）同ALPPS-matri組；（3）不離斷中肝葉，直接關(guān)腹。二期手術(shù)包括以下步驟：（1）同ALPPS-micro組；（2）在中葉缺血線處離斷中肝葉；（3）切除萎縮的左中葉、左葉、右葉和尾狀葉。Control-matri組作為對(duì)照，用于驗(yàn)證手術(shù)的有效性和安全性。

3組小鼠一期及二期手術(shù)后接受同樣的術(shù)后護(hù)理：皮下補(bǔ)液1 mL（500 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10%的葡萄糖注射液，500 μL乳酸鈉林格鈉注射液，8000 U青霉素）；30 ℃保溫墊復(fù)溫24h。所有手術(shù)操作均由同一術(shù)者完成，術(shù)者接受過(guò)系統(tǒng)外科訓(xùn)練并有100 h以上的顯微外科操作經(jīng)驗(yàn)。

1.3 術(shù)中出血量評(píng)估

術(shù)中出血量根據(jù)棉簽吸血情況估算。棉簽吸血面積＜30%，失血量為50 μL；吸血面積占30%～70%，失血量為100μL；吸血面積＞70%，失血量為200μL；棉簽被血浸透，失血量為300μL。

1.4 取材

分別于一期手術(shù)后第0、2、4、6、8天根據(jù)剩余存活小鼠數(shù)量及取材次數(shù)，隨機(jī)抽取3～4只小鼠，異氟烷麻醉后稱其體質(zhì)量，并通過(guò)眼眶后靜脈叢取血500 μL。隨后采用頸椎脫位法處死小鼠，摘取肝臟并稱其質(zhì)量，計(jì)算肝臟質(zhì)量與體質(zhì)量的比值（即肝體比）。將靜脈血離心所得的血清及部分肝臟凍存于－80 ℃，其余肝臟經(jīng)4%甲醛溶液固定后石蠟包埋。

1.5 生存情況觀察

每日觀察并記錄小鼠術(shù)后生存情況。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行尸檢，探查并記錄腹腔內(nèi)是否有積血和腹腔積液。

1.6 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

血清解凍后，用全自動(dòng)生化儀（購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，型號(hào)：BS-200）檢測(cè)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Ccnd1基因轉(zhuǎn)錄水平

冷凍肝組織在TRIzol試劑（購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：15596026）中充分振蕩裂解后，采用乙醇沉淀法提取RNA。RNA在MMLV體系（購(gòu)自瑞士Roche公司）中反轉(zhuǎn)錄為cDNA。接著采用SYBR Green PCR Master Mix體系（購(gòu)自瑞士Roche公司，批號(hào)：04913914001）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（購(gòu)自瑞士Roche公司，型號(hào)：LightCycler 96）檢測(cè)編碼Cyclin D1蛋白的Ccnd1基因轉(zhuǎn)錄水平。Ccnd1引物序列如下：上游引物為5'-GCGTACCCTGACACCAATCTC-3'，下游引物為5'-ACTTGAAGTAAGATACGGAGGGC-3'。內(nèi)參β-actin引物序列如下：上游引物為5'-GTCGTACCACAGGCATTGTGATGG-3'；下游引物為5'- GCAATGCCTGGGTACATGG-TGG-3'。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 15 s，60 ℃30 s，72 ℃ 40 s，循環(huán)40次；72 ℃ 5 min。應(yīng)用2－ΔΔCt法計(jì)算Ccnd1基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Cyclin D1蛋白表達(dá)

冷凍肝組織在IP裂解液中充分振蕩裂解后，通過(guò)BCA試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，貨號(hào)：23227）測(cè)定蛋白濃度。采用12%SDS-PAGE將蛋白樣品進(jìn)行電泳分離，并濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。分別孵育抗Cyclin D1（工作液體積稀釋比例為1∶100的兔抗鼠單克隆抗體，購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab16663）和GAPDH（工作液體積稀釋比例為1∶5000的兔抗鼠多克隆抗體，購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab9485）的一抗及相應(yīng)的熒光素偶聯(lián)二抗（工作液體積稀釋比例為1∶5000的驢抗兔單克隆抗體，購(gòu)自上海臻諾生物科技有限公司，批號(hào)：926-68023）。使用熒光掃描儀（美國(guó)Li-Cor公司產(chǎn)品，型號(hào)：Odyssey 9120）采集圖像。

1.9 免疫組織化學(xué)法分析Ki-67表達(dá)

將小鼠肝臟石蠟組織進(jìn)行切片，切片厚度為5μm。將切片常規(guī)脫蠟，過(guò)氧化氫封閉后，采用檸檬酸緩沖液高溫高壓法修復(fù)抗原。分別孵育抗Ki-67的一抗（工作液體積稀釋比例為1∶500的兔抗鼠單克隆抗體，購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab92742）及相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗（工作液體積稀釋比例為1∶200的羊抗兔多克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)Boster公司，批號(hào)：BA1058）。經(jīng)DAB（購(gòu)自美國(guó)Boster公司，批號(hào)：AR1025）顯色和蘇木精染色細(xì)胞核后脫水封固。采用HALO數(shù)字病理圖像分析平臺(tái)（美國(guó)Indica Labs公司產(chǎn)品，版本：1.13）分析切片中Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞（細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色）所占比例。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13. 0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析各實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的連續(xù)性變量以±s表示。采用單因素方差分析進(jìn)行多組間差異比較；當(dāng)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。分類變量采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并計(jì)算生存率；因取材而處死的小鼠不計(jì)入死亡，按其取材時(shí)間計(jì)為刪失病例；生存情況的組間比較采用log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)及生存情況

與ALPPS-matri組相比，ALPPS-micro組一期手術(shù)平均操作時(shí)間更長(zhǎng)[（37.5±9.3）min 比（19.0±4.6）min，P＜0.05]（圖2A），術(shù)中出血量更多[（317±124）mL 比（153±39）mL，P＜0.05]（圖2B）。ALPPS-micro組一期手術(shù)的圍手術(shù)期有5只小鼠死亡，其中3只術(shù)中損傷血管導(dǎo)致失血過(guò)多而死亡，2只于術(shù)后12 h內(nèi)死亡。解剖術(shù)后死亡小鼠，可見(jiàn)腹腔大量血凝塊，提示死亡原因是由于術(shù)中止血不徹底引起術(shù)后失血性休克。

ALPPS-matri組和Control-matri組一期手術(shù)后，各組僅1只小鼠死亡（表1）。ALPPS-micro組一期手術(shù)死亡率顯著高于ALPPS-matri組（5/25比1/25，P＜0.05）。二期手術(shù)的圍手術(shù)期ALPPS-micro組、ALPPS-matri組和Control-matri組小鼠分別死亡4只、3只和7只，其中因手術(shù)操作導(dǎo)致術(shù)中出血引起的死亡分別為1只、1只和2只，其余小鼠均在二期手術(shù)24h后死亡。

解剖死亡小鼠，腹腔未見(jiàn)明顯血凝塊，但存在腹腔積液，提示死亡原因是由于肝功能衰竭（表1）。術(shù)后8 d內(nèi)各組所有小鼠的生存曲線顯示，ALPPS-matri組的圍手術(shù)期生存率高于ALPPS-micro組（P＜0.05，圖2C）。

圖2 不同實(shí)驗(yàn)組小鼠的手術(shù)時(shí)間（A）、術(shù)中出血量（B）和圍手術(shù)期生存情況（C）Figure 2 Operation time (A), intraoperative bleeding (B) and perioperative cumulative survival curves (C) of mice in different groups

表1 不同實(shí)驗(yàn)組小鼠的手術(shù)情況及圍手術(shù)期生存情況Table 1 Operation characteristics and perioperative survival of mice in different groups

2.2 肝臟再生水平

ALPPS-micro組和ALPPS-matri組的術(shù)后肝體比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3A）。具體來(lái)說(shuō)，兩組ALPPS小鼠在一期術(shù)后均有一個(gè)肝體比快速恢復(fù)的過(guò)程，而Control-matri組一期術(shù)后肝體比恢復(fù)速率明顯慢于前兩組（P＜0.05）；二期術(shù)后兩組ALPPS小鼠的肝再生速率雖有所減慢，但依然高于Control-matri組（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，基質(zhì)膠封堵門靜脈法可以取得與顯微手術(shù)結(jié)扎法近似的肝體比恢復(fù)速率。

2.3 肝功能恢復(fù)情況

ALPPS-micro組和ALPPS-matri組的血清ALT和AST水平在一期術(shù)后顯著升高（均P＜0.05），這可能與大面積的肝臟缺血導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷有關(guān)；二期手術(shù)切除所有缺血肝臟以后，ALT和AST水平明顯下降（均P＜0.05），二期術(shù)后第4天即接近正常水平（圖4）。

圖3 不同實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝體比恢復(fù)情況（A）、術(shù)后肝組織中Ccnd1基因轉(zhuǎn)錄（B）和Cyclin D1表達(dá)（C）Figure 3 Liver weight to body weight ratio (A), Ccnd1 gene transcription (B) and Cyclin D1 protein expression (C) in liver tissues of mice in different groups

2.4 肝臟內(nèi)細(xì)胞增殖水平

實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的Ccnd1基因轉(zhuǎn)錄水平和Cyclin D1蛋白表達(dá)水平在ALPPS-micro組和ALPPS-matri組之間沒(méi)有明顯差異（P＞0.05），但均高于Control-matri組（均P＜0.05）（圖3B～C）。

針對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)抗原Ki-67的免疫組織化學(xué)染色及其定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果也顯示，兩組ALPPS術(shù)后小鼠肝組織內(nèi)增殖細(xì)胞的比例接近（P＞0.05），且均大于Control-matri組（均P＜0.05）（圖5）。

圖4 不同實(shí)驗(yàn)組小鼠術(shù)后血清ALT和AST的變化情況Figure 4 Serum ALT and AST levels of mice in different groups

圖5 不同實(shí)驗(yàn)組小鼠術(shù)后肝組織中Ki-67的免疫組織化學(xué)染色及定量分析結(jié)果Figure 5 Immumohistochemical staining and Ki-67 positive rate in liver tissues of mice in different groups

3 討論

基于中大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的ALPPS模型雖然在手術(shù)操作上較為簡(jiǎn)便，但其繁育周期長(zhǎng)，飼養(yǎng)成本高；并且隨著機(jī)制研究的深入，需要構(gòu)建基因編輯動(dòng)物模型以深入研究基因功能，這時(shí)中大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行基因編輯的成本和難度非常大[8-9]。而小鼠雖然在繁育周期、飼養(yǎng)成本、基因編輯成本和難度上相比于中大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有顯著優(yōu)勢(shì)，但其門靜脈分支和肝動(dòng)脈分支的直徑分別僅為0.7～0.8 mm和0.05～0.08 mm[10]，必須借助手術(shù)顯微鏡等顯微外科器械才能完成ALPPS手術(shù)中分離與結(jié)扎血管的操作，而且術(shù)中出血多，手術(shù)成功率較低，這大大限制了小鼠在ALPPS機(jī)制研究中的應(yīng)用。

基質(zhì)膠是近年來(lái)在類器官培養(yǎng)領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛的一種試劑[11]，其在0～4℃時(shí)為液態(tài)，＞10 ℃又會(huì)聚合為固態(tài)。利用這一特點(diǎn)，將基質(zhì)膠在液體狀態(tài)下注射入門靜脈分支。由于小鼠體溫較高，進(jìn)入血管的基質(zhì)膠迅速聚合為固態(tài)，堵塞血管，造成事實(shí)上的血流阻斷效果。并且，聚合后的基質(zhì)膠凝固在進(jìn)針口附近，還可起到阻止針道出血的作用。這一方法較傳統(tǒng)的顯微鏡下分離結(jié)扎血管，操作更為簡(jiǎn)單，在縮短手術(shù)時(shí)間的同時(shí)，還可以減少術(shù)中出血，降低術(shù)后出血死亡風(fēng)險(xiǎn)。雖然基質(zhì)膠在長(zhǎng)期培養(yǎng)的環(huán)境下存在崩解的可能[12]，但是由于ALPPS一期和二期手術(shù)之間僅相隔2 d；就目前的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)看，未發(fā)現(xiàn)2 d內(nèi)基質(zhì)膠在體內(nèi)崩解的情況。國(guó)際上已經(jīng)有將基質(zhì)膠替代高嶺土，用于誘導(dǎo)梗阻性腦積水的報(bào)道[13]。本研究進(jìn)一步擴(kuò)展了基質(zhì)膠在脈管阻塞相關(guān)動(dòng)物模型中的應(yīng)用。

ALPPS手術(shù)的兩個(gè)要點(diǎn)分別為阻斷單側(cè)門靜脈血流和離斷肝組織。在ALPPS手術(shù)成熟前，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)單純阻斷單側(cè)門靜脈血流的門靜脈結(jié)扎（portal vein ligation，PVL）手術(shù)也可以加速肝臟的再生，但其肝體比恢復(fù)速率慢于ALPPS手術(shù)[14]。目前的機(jī)制研究認(rèn)為，PVL手術(shù)后肝再生速率較慢的原因是其僅僅改變了血流分布，而沒(méi)有通過(guò)離斷肝臟引起大面積的炎性反應(yīng)[2]。本研究中設(shè)置Control-matri組的目的有2個(gè)：一是模擬PVL手術(shù)并將其作為對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)改良的ALPPS模型確實(shí)體現(xiàn)了ALPPS術(shù)后肝臟快速再生的兩大驅(qū)動(dòng)因素，即血流的重分布和大面積的炎性反應(yīng)，且再生速率高于PVL；二是為了排除基質(zhì)膠自身對(duì)肝再生的影響。目前尚沒(méi)有研究探討基質(zhì)膠直接注入循環(huán)系統(tǒng)以后是否會(huì)對(duì)肝臟的生理功能產(chǎn)生影響，將Control-matri組作為對(duì)照，可以排除基質(zhì)膠在體內(nèi)除了物理封堵以外的其他因素對(duì)肝再生可能造成的影響。

肝體比數(shù)據(jù)和肝內(nèi)細(xì)胞增殖水平檢測(cè)結(jié)果提示，基質(zhì)膠封堵門靜脈法可以取得與顯微手術(shù)結(jié)扎法近似的肝體比恢復(fù)速率及肝臟內(nèi)細(xì)胞增殖水平。而且基質(zhì)膠封堵法較顯微結(jié)扎法可以明顯減少ALPPS一期手術(shù)中出血量，縮短手術(shù)時(shí)間，降低一期手術(shù)后出血死亡風(fēng)險(xiǎn)；但是兩種方法在術(shù)后肝功能衰竭死亡率上沒(méi)有明顯區(qū)別。ALT和AST的檢測(cè)結(jié)果也顯示，兩種手術(shù)方式對(duì)圍手術(shù)期肝功能的影響具有一致性。這些結(jié)果說(shuō)明，改良ALPPS手術(shù)可以模擬傳統(tǒng)ALPPS手術(shù)對(duì)肝臟的影響，用于ALPPS手術(shù)中肝臟再生的機(jī)制研究。

利用基質(zhì)膠封堵門靜脈法建立的改良ALPPS手術(shù)小鼠模型也存在不足之處：（1）相較于結(jié)扎血管造成門靜脈血流阻斷的徹底性，基質(zhì)膠封堵門靜脈血流的徹底性有待證實(shí)；（2）大鼠實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)血管內(nèi)血流量較大時(shí)，進(jìn)入血管的基質(zhì)膠會(huì)被迅速稀釋，無(wú)法形成有效的凝膠團(tuán)堵塞血管。因此，該模型僅適用于小鼠，可能無(wú)法擴(kuò)展至其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，采用基質(zhì)膠封堵門靜脈法建立的改良ALPPS小鼠模型，可以達(dá)到和基于顯微手術(shù)的ALPPS小鼠模型近似的刺激肝臟再生的效果，并且改良ALPPS模型的手術(shù)時(shí)間更短，術(shù)中出血更少，圍手術(shù)期死亡率更低。