高通量測序在種群遺傳學中的分析方法

任 月,王政昆,朱萬龍

(云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動植物生態(tài)適應進化及保護重點實驗室，云南師范大學 生命科學學院， 生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心，云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術重點實驗室，云南 昆明 650500)

1 引言

測序技術能夠提供大量的遺傳信息資源，可以描述個體基因組、轉(zhuǎn)錄信息和群體疾病中的遺傳變異, 隨著基因組分析、基因組操作技術和高通量分子生物學的進一步突破，基因型和表型之間的關聯(lián)研究也越來越受重視。在2004年，雖采用毛細管測序儀，獲得人類30億堿基基因組序列的原始數(shù)據(jù)[1]，但成本較貴，隨后發(fā)展出通量高、成本低的高通量測序技術[2]，其能夠提取高生物學價值的遺傳信息，成為分析種群內(nèi)、種群間以及不同類群的遺傳多樣性和遺傳分化程度的基因組學研究的重要方法之一[3，4]，本研究綜述了高通量測序技術在動物種群遺傳學究中的主要分析方法，希望為種群遺傳學研究奠定一定的基礎。

2 高通量測序的發(fā)展

1977年，DNA鏈末端合成終止法作為第一代測序技術，即Sanger法[5]。其操作步驟簡單、準確度高，廣泛應用于各個領域，但其成本高，通量低，因此，2006年發(fā)展出高通量測序，別稱新一代測序(next-generation sequencing, NGS)。NGS是邊合成邊測序技術，具有通量高、成本低、速度快和后期數(shù)據(jù)分析處理成熟等優(yōu)點，且能夠?qū)蝹€物種的基因組和轉(zhuǎn)錄組進行深入研究，使其廣泛應用到科學研究和醫(yī)療方面[6]。NGS常用的平臺包括三種，分別為使用橋式 PCR進行擴增的Illumina的基因組分析儀[2]、使用微乳滴PCR進行擴增Roche454基因組測序儀[7]以及使用微球和微乳滴方法進行擴增的ABLifeTechnologies的SOLiD系統(tǒng)[8]。因NGS具有局域擴增偏好性和讀長短的缺點，產(chǎn)生以PacBio的SMART的技術，半導體測序技術和納米孔單分子測序技術為代表的第三代測序[9]。測序技術的發(fā)展歷程見圖1。

3 利用高通量測序?qū)ΨN群遺傳學的分析方法

1966年，首次對果蠅[10]和人類[11]的遺傳變異的研究認為生物進化是種內(nèi)的遺傳變異轉(zhuǎn)化為種間遺傳變異成新群體的過程，但由于技術上的局限，僅能檢測并分析少量基因座的差異性，隨著重測序技術的發(fā)展，大量的模式動物和野生動物種群遺傳學原始數(shù)據(jù)被挖掘[12]，對種群遺傳學進一步拓展和深化，有利于對動物多樣性的保護和生物資源的可持續(xù)利用。

3.1 種群遺傳結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)表型或基因型的變異性可以推斷出不同群體的親緣關系[13]，利用重測序獲得生物DNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹是以分支圖或樹的形式來描述種群內(nèi)和種群間進化順序，來分析生物進化過程，一般通過NJ法和ML法構(gòu)建群體的進化樹[14]。主成分分析(PCA)是一種純數(shù)學的運算方法，可以將多個相關變量經(jīng)過線形轉(zhuǎn)換選出較少個數(shù)的重要變量，減少數(shù)據(jù)的維數(shù)，同時保留數(shù)據(jù)集中的大部分變化，它通過識別主成分來實現(xiàn)這種減少，沿著主成分數(shù)據(jù)的變化，通過使用幾個組件，每個樣本可以用相對較少的數(shù)字來表示，而不是用數(shù)千個變量的值。然后，樣本以圖形可視化，從而可以直觀地評估樣本之間的相似性和差異性，并確定樣本是否可以分組[15]。

3.2 選擇信號檢測

3.2.1 選擇性消除主要包括幾種表現(xiàn)形式

(1)在宏觀進化水平上檢測選擇：在宏觀進化水平上檢測選擇的方法通常在相關分類群中的同源特征或序列的比較上進行鉸鏈，可能是保守的功能性的序列，然后以進化速率搜索譜系特異性的加速度。

(2)基于基因組的方法：用于檢測選擇的已知統(tǒng)計信息是Ka/KS，也稱為dn/ds或ω[16]。該統(tǒng)計量將每個位點的非同義替換率與每個位點同義替換的速率進行比較。由于同義變化假定為功能沉默，它們的取代率提供了能夠解釋氨基酸改變的速率的基線。相對過量的非同義替換表明正在進行積極選擇，有利于新的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的陰性選擇。

(3)基于頻譜的方法：基于群體內(nèi)等位基因頻率分布的中性檢驗，即用中性理論作為零假設,Tajima’s D是第一個，也是最常用的檢測信號的測試[17]。

(4)在微觀進化水平上檢測選擇：正向選擇使有利的等位基因在種群中迅速傳播至固定。

3.2.2 微進化水平上檢測包括

(1)有益的突變使附近的搭便車者變異頻率高，導致所選位點周圍的遺傳多樣性在全群體范圍內(nèi)減少。

(2)有益的突變使附近的衍生等位基因頻率較高。

(3)選擇性掃描導致延伸的單倍型純合性，在包含所選等位基因的單倍型上升。

(4)等位基因頻率的差異反映群體特定的選擇作用，導致兩個群體之間賴特固定指數(shù)增加；將來自多個選擇信號的信息綜合起來的綜合方法可以提供更好的分辨率，并有助于查明因果變量[18]。

(5)連鎖不平衡的方法：指群體內(nèi)不同座位等位基因間的非隨機關聯(lián)，即等位基因關聯(lián)，連鎖不平衡水平越高，表明連鎖緊密。

(6)基于種群分化方法：不同種群受到不同的環(huán)境壓力導致種群的適應特性不同。比較群體內(nèi)和群體間等位基因頻率的差異的群體分化指標是Wright 固定指數(shù)[19]。Fst值相對較大，表明種群間存在顯著差異，意味該位點在定向選擇。相對較小的Fst值表明被比較的種群是同質(zhì)的。

圖1 測序技術發(fā)展歷程

3.3 種群歷史動態(tài)的重建和研究方法

種群歷史動態(tài)以有效種群大小對時間發(fā)生變化為參考標準，通過結(jié)合個體基因組的雜合位點的局部密度變化和種群的多態(tài)性位點或者系統(tǒng)發(fā)生樹來反映種群和物種的進化歷程[14, 19]，有助于對瀕危物種制定合理有效的保護策略。種群不同歷史時期有效群體大小的方法主要采用成對序列馬可夫溯祖分析(pairwise sequential Markovian coulescent，PSMC)和多序列馬爾科夫溯祖分析(multiple sequential Markoisn cosledcent analysis，MSMC)[21]。

PSMC方法是采用馬爾科夫溯祖模型為二倍體個體的全基因組數(shù)據(jù)重建有效種群大小變化過程[20]，其可推斷出每個相關DNA片段的最新共同祖先，基于合并事件速率和TMRCA的分布，推斷出在給定時間紀元的祖先的有效種群大小[22]，來物種保護提供非常重要的遺傳學信息。PSMC分析廣泛應用于多個種群歷史動態(tài)研究中。但PSMC方法預測種群歷史范圍有限，無法估計近期的種群歷史狀態(tài)，進而發(fā)展出MSMC方法[21]，通過MSMC計算相對交聯(lián)率可獲得20000年內(nèi)的種群遺傳變化，并詳細模擬兩種群之間遺傳分化的歷史。結(jié)合MSMC和PSMC兩種方法能擴大時間尺度去獲得種群歷史動態(tài)。

綜上所述，通過高通量測序和生物信息學分析結(jié)合，研究物種，尤其是瀕危物種的遺傳變異和分布規(guī)律來推測種群歷遺傳進化，為物種的保護奠定了遺傳學基礎。

4 展望

物種形成過程中經(jīng)過自然選擇，出現(xiàn)表型分化，進而影響基因頻率變化。通過對相關DNA的測序來篩選整個基因組中的數(shù)千個位點。按順序進行基因分型，如SNP基因分型，甚至全基因組測序能夠識別群體或生態(tài)類型之間差異極高位點，認為這些是適應進化和生殖孤立的跡象。但是如何將基因組學方法與其他生態(tài)學方法結(jié)合來解決問題，特別是那些直接解決從基因到表型到環(huán)境的聯(lián)系，把基因組學和生態(tài)學聯(lián)系起來的方法，建立從基因型到表型，從表型到適應和生殖分離的功能聯(lián)系還有待探究。